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天然免疫是机体的第一道防御屏障,其通过一系列模式识别受体(PRRs)识别各种病原微生物产生的病原相关分子模式(PAMPs)。其中RIG-I样受体家族(RLRs)为胞浆内主要RNA识别受体,包括RIG-I、MDA5和LGP2。MDA5能够识别长双链RNA,并将信号传递给下游接头蛋白MAVS以介导信号通路,产生干扰素、促炎因子以及相关趋化因子,最终启动天然免疫抵御病原微生物。MDA5识别RNA病毒,也有研究证明MDA5能够识别DNA病毒和寄生虫复制过程中产生RNA以及细胞内源RNA。由于鸡缺失RIG-I,鸡MDA5(chMDA5)发挥关键作用。本研究从鸡细胞中克隆出鸡源MDA5,构建chMDA5及其信号接头蛋白chMAVS真核表达载体并验证两者表达及信号功能。同时通过DF-1细胞转染表达与敲除系统检验chMDA5和chMAVS的抗病毒作用以及二者之间的信号功能关系。最后构建chMDA5原核表达质粒,纯化细菌表达蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体为后续试验提供服务。1.chMDA5和chMAVS的克隆表达及其信号功能本研究从HD11细胞中RT-PCR扩增出chMDA5编码基因,与中间载体pENTER4-MCS-3FLAG连接获得重组中间质粒pENTER4-chMDA5-3FLAG。同时将合成chMAVS基因同样克隆到中间载体获得重组中间质粒pENTER4-chMAVS-3FLAG。将重组中间质粒分别与目的载体pDSET47特异位点性重组(LR)获得重组真核表达质粒pcDNA-chMDA5-3FLAG 和 pcDNA-chMAVS-3FLAG。Western blotting 检测 chMDA5 与chMAVS在转染293T细胞中表达,蛋白大小分别是140kDa和50kDa,符合预期。荧光共聚焦显微镜表明chMDA5和chMAVS都定位于细胞浆,但不存在明显共定位。启动子双荧光素酶报告基因和RT-PCR方法检测chMDA5和chMAVS的信号功能,结果显示chMDA5和chMAVS共转染293T细胞激活NF-κB通路,显著上调IL-1β与IL-8的转录。而共转染DF1细胞激活鸡IFNβ启动子,上调细胞下游基因IFNβ和OASL表达,上述结果差异显示了细胞种属特异性。此外信号接头蛋白也表现出种属特异性,与前述chMDA5和chMAVS共转染293T细胞只激活NF-κB相对照,chMDA5和猪(p)MAVS共转染可以有效激活细胞ISRE和NF-κB信号。定量RT-PCR方法检测鸡不同组织内chMDA5和chMAVS转录分布,发现chMDA5和chMAVS分布情况较为一致,主要集中在消化腺和肠道,其次是肺脏和脾脏。2.chMDA5和chMAVS转染表达与敲除对RNA和DNA病毒复制的影响DF1细胞用于单独或共转染chMDA5和chMAVS表达质粒,转染细胞用不同病毒感染刺激,包括RNA病毒水泡性口炎病毒(VSV)、仙台病毒(SeV)、脑心肌炎病毒(EMCV)、鸡新城疫病毒(NDV)和DNA病毒痘苗病毒VacV株、SMV株。qRT-PCR检测感染细胞中病毒复制基因和细胞下游基因表达情况。根据已知序列利用Benchling软件分别设计chMDA5和chMAVS的gRNA编码DNA序列(引物),引物退火后与plentiCRISPRv2载体连接,获得重组敲除质粒gMDA5与gMAVS。敲除gRNA质粒和相应真核表达质粒共转染293T细胞检验gRNA敲除效率,挑选其中敲除效果较好gRNA质粒用于细胞转染实验。DF1用于单独或共转染gMDA5和gMAVS基因敲除质粒,转染细胞同样用上述不同RNA和DNA病毒感染刺激,qRT-PCR检测感染细胞中病毒复制基因和细胞下游基因表达情况。结果显示转染表达与敲除细胞系统中,chMDA5-chMAVS能够响应RNA病毒VSV、SeV、EMCV、NDV并产生IFN与OASL以影响病毒复制,chMDA5-chMAVS表达DF-1细胞系统中上述RNA病毒复制受到抑制,而敲除细胞系统中RNA病毒复制得到提高。同时,chMDA5和chMAVS共表达能够进一步增强抑制RNA病毒效果,而共敲除细胞系统中RNA病毒复制进一步升高。因此chMDA5与chMAVS在抗RNA病毒天然免疫中起到至关重要的作用。DNA病毒感染细胞结果表明,内源性chMDA5和chMAVS不影响病毒复制和下游病毒刺激基因表达,因此chMDA5-chMAVS在抗DNA病毒感染中无显著作用。3.chMDA5的多抗制备将pENTER4-chMDA5与原核目的载体pDSET527通过特异位点同源重组(LR)获得重组原核表达质粒。表达质粒转化细菌BL21(DE3),大量扩增后使用IPTG诱导chMDA5蛋白表达。从细菌裂解上清中分离获得大小符合预期的可溶性chMDA5蛋白。将分离蛋白纯化并浓缩后进行定量,免疫BALB/c小鼠(每次15μg/只),三次免疫后采集血清。Western blotting检测发现,血清多抗能够检测外源表达chMDA5。