论文部分内容阅读
背景:肌腱损伤是运动医学领域常见的疾病,30-50%的运动损伤与肌腱相关。由于肌腱组织结构的特殊性,肌腱组织内血管含量较少,导致其自身修复愈合能力较差,愈合后容易出现瘢痕及钙化等并发症,并且存在再次断裂的风险,因此,寻找理想的促进肌腱修复的方法十分必要。近十年来,肌腱干细胞（tendon-derived stem cells,TDSCs）的发现为肌腱修复提供了新的思路。与最为常用的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）相比,TDSCs显示具有更强的集落形成能力、增殖能力以及向成肌腱分化的能力,并可以促进肌腱再生,抑制局部炎症反应。因此,TDSCs可以作为修复肌腱损伤的理想细胞来源。但是目前,干细胞治疗在临床应用方面仍存在一定的局限性:1.异体细胞可能会引起免疫排斥以及病原体的传播;2.存在形成肿瘤的风险;3.细胞的储存、运输存在困难等。业已明确,外泌体（Exosomes）是细胞旁分泌的重要成分之一,外泌体是直径为30-150nm的具有双层膜结构的囊泡,内含有大量的生物分子,包括蛋白质、脂质、DNA、m RNA、miRNA和其他非编码RNA。当细胞摄取了这些外泌体后,外泌体内含的这些物质便在受体细胞内发挥相应的功能,从而调节受体细胞的状态和功能。近年来,有大量文献报道,外泌体有明显地促进组织的的修复作用。目前尚不清楚是否TDSCs具有促进肌腱修复的效应。本课题将研究TDSCs-Exos是否能促进损伤肌腱的修复,并探索其机制。目的:1、分离培养TDSCs、并在此基础上提取TDSCs来源的外泌体。2、体外研究TDSC-Exos对肌腱细胞（TC）的存活,增殖及分化的影响;构建外泌体生物支架（p HA-TDSC-Exos）,体内研究TDSCs来源的外泌体在大鼠肌腱缺损模型中的促进肌腱修复效应。3、从外泌体中miRNA入手,初步探索TDSC-Exos促进肌腱损伤修复的分子机制。方法:1、用酶消化技术从大鼠肌腱中分离获得TDSCs,体外原代培养,并在此基础上用流式细胞术对细胞表面抗原进行鉴定,和用体外培养诱导实验对TDSCs的多系分化潜能进行鉴定。2、收集TDSC的P3-P6代细胞培养的培养上清液,通过超速离心法提取TDSC来源的外泌体,通过透射电镜观察TDSC-Exos的形态结构,Nanosight粒径分析仪观察其粒径分布,用Western Blot技术进一步检测外泌体膜上特异性蛋白的表达。3、通过共聚焦显微镜观察,证实外泌体能被肌腱细胞所摄取,在体外培养模型,通过检测肌腱细胞Ⅰ型胶原分泌、特异性m RNA表达等试验。验证TDSC来源的外泌体对肌腱细胞增殖、迁移、分化、抗饥饿、抗氧化应激的作用。4、用SD大鼠构建髌腱缺损模型,并在此基础上,将制备的光交联透明质酸肌腱干细胞外泌体生物支架（p HA-TDSC-Exos）置于缺损处,将对照组分别由不植入任何材料组和仅含有透明质酸支架组（p HA）构成。术后2、4、8周取材,进行组织形态学分析,术后8周取材进行生物力学分析。5、分别提取TDSC-Exos和TC-Exos,通过Microarray筛选出两者中差异性表达的miRNA,挑选出排名前10的miRNA,对miRNA的靶基因进行预测,随后对靶基因进行GO功能富集分析和KEGG生物学通路富集分析,进而对TDSC-Exos发挥作用可能涉及的生物学通路进行推演。结果:1、建立了稳定可靠的大鼠原代肌腱干细胞和肌腱细胞培养方法,TDSC,CD90、CD44表达阳性,CD31、CD106表达阴性;TDSC在低密度培养时能形成集落,并具有成软骨、成骨和成脂肪分化的多向分化能力。2、通过超速离心法成功分离提取TDSC-Exos,其呈双面凹的圆形或椭圆形,直径在130nm左右,并表达外泌体特异性标记蛋白（CD63,CD81,CD9及TSG101）。3、TDSC-Exos能促进肌腱细胞增殖、迁移、成腱分化、并有抗饥饿、抗氧化应激的作用。同时TDSC-Exos能促进肌腱细胞Ⅰ型胶原分泌、特异性m RNA表达。4、p HA-TDSC-Exos生物支架可显著促进大鼠髌腱损伤的愈合及功能性修复。5、对提取的TDSCs-Exos及TC-Exos进行测序,筛选出两者中差异性表达的miRNA,对miRNA的靶基因进行预测,随后对靶基因进行GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）分析,TDSC-Exos中差异性表达的miRNA与MAPK通路、m TOR通路、PI3K-Akt通路、HIF-1等通路相关联。结论:肌腱干细胞来源的外泌体能有效促进大鼠髌腱缺损模型中髌腱损伤的愈合及功能性修复,该效应可能与外泌体促进肌腱细胞的增殖、迁移、成腱分化、并有抗饥饿、抗氧化应激等作用相关联,其潜在的部分效应机制可能与TDSC-EXos中所含的特定miRNA相关联,这些miRNA可能是通过参与了MAPK通路、m TOR通路、PI3K-Akt通路、HIF-1等通路的调节来实现的。