论文部分内容阅读
本研究分为两部分。 第一部分 糖皮质激素受体通路在共轭亚油酸诱导的小鼠脂肪组织减少中的作用 共轭亚油酸(CLA)已作为食品添加剂广泛使用，但能够引起小鼠的脂肪营养不良等机体的代谢紊乱。我们以往发现CLA能够显著降低围脂滴蛋白(perilipin1)的表达，并引起小鼠脂肪组织的异常脂解。因此本实验的目的就是为了进一步探讨CLA引起小鼠脂肪组织plin1异常下降的原因。我们对Plin1基因上游的糖皮质激素受体(GR)进行了研究。首先在两组(n=12)6周龄雄性昆明小鼠的日粮中分别添加1.5％的CLA（试验组）或亚油酸(LA，对照组)，13天后诱导出脂肪组织减少，测定血浆中皮质醇(cortisol)的含量，检测小鼠附睾脂肪组织中GR的mRNA水平，并且分别克隆小鼠GR启动子和带有GRE的Plin1启动子，让这些启动子控制荧光素酶基因，构建pGL3-GR和pGL3-Plin1(GRE)重组质粒。在Hela细胞中检测地塞米松(DEX)对GR启动子活性的影响，在此基础上进一步检测CLA对DEX刺激后GR启动子的影响，同时本实验还检测了DEX对Plin1启动子活性的影响。结果显示，与对照组相比，饲喂CLA的小鼠的血浆中的cortisol含量显著下降(P＜0.05)，荧光定量PCR发现附睾脂肪组织中GR的mRNA表达水平显著下降(P＜0.05)。荧光素酶报告基因系统检测发现，在转染GR启动子的Hela细胞中，DEX能使GR启动子的活性显著升高(P＜0.05)，但是CLA的添加则会抑制这种反应。在转染Plin1（含GRE）启动子的Hela细胞培养液中添加DEX则能显著增加Plin1（含GRE）启动子活性(P＜0.01)。以上结果表明:CLA不仅能够使小鼠体内皮质醇(cortisol)含量下降，而且能使GR的表达下降;体外试验表明，CLA通过抑制GR启动子的活性进而抑制GR的表达，Dex能够增加Plin1启动子的活性。CLA通过抑制cortisol含量和GR的表达从而抑制GR靶基因Plin1的表达，从而导致脂肪组织异常脂解，最终引起脂肪减少。 第二部分 糖皮质激素受体通路在二花脸猪高皮质醇耐受中的作用 糖皮质激素(GC)通过糖皮质激素受体(GR)结合在动物的生理代谢过程中发挥着重要的作用。据报道，在同等的运输应激的条件下，二花脸和皮特兰猪的应激反应变现差异，二花脸猪并没有表现出明显的应激反应，皮特兰猪的应激反应比较强烈，通过检测两品种猪血清中的皮质醇(cortisol)含量发现，二花脸的cortisol含量显著高于皮特兰猪。另有报道，在基础代谢的条件下，二花脸猪血清中的cortisol含量也约是大白猪的2倍。两种不同的实验共同表明二花脸猪体内存在高皮质醇耐受的现象，GR信号的传导通路发生了障碍。因此，本实验的目的就是为了研究二花脸高皮质醇耐受产生的机制。首先本实验取4-5周龄的二花脸和大白猪，处死后取血制备血清检测cortisol的含量。P65作为NF-κB基因的亚基，在GR的信号通路中能够与GR竞争性的结合某种蛋白从而降低GR靶基因的表达。然后本实验取两品种猪的肝脏组织，用实时荧光定量PCR的方法检测GR基因及P65基因的信使核苷酸(mRNA)水平的表达差异性。为了进一步研究二花脸猪应激不敏感的机制，本实验克隆了GR下游的靶基因Plin1基因的启动子，该启动子上含有GRE序列，让这一启动子控制荧光素酶基因的表达，构建pGL3-pigPlin1（GRE）重组质粒，在Hela细胞中，转染该重组质粒，用地塞米松(DEX)刺激转染细胞，检测其荧光素酶报告基因的活性;共转染Plin1(GRE)启动子和P65，用Dex刺激转染细胞，检测荧光素酶报告基因的活性。结果显示:二花脸猪血清中的cortisol含量显著高于大白猪(P＜0.05)，前者约是后者的两倍;在mRNA水平上，二花脸猪的肝脏组织的GR基因和P65基因都显著高于大白猪。在体外试验中，荧光素酶报告系统显示，Dex刺激使GR靶基因启动子Plin1的活性升高，在Dex的刺激条件下，P65与GR靶基因启动子Plin1的共转染显著降低了GR靶基因的表达(P＜0.05)。以上结果表明:二花脸猪的高皮质醇耐受现象象可能与P65基因的上调有关。