论文部分内容阅读
红茶菌是以茶糖水为发酵基质,经醋酸菌、酵母菌和乳酸菌等天然存在的混合菌群发酵而成的饮料,包含菌液和菌膜两部分。本研究利用宏基因组技术准确掌握红茶菌发酵过程中微生物菌群组成及代谢途径的初步分析,序列已提交至GenBank数据库,登录号 SRP103682。采用正交试验设计,以1 5%蔗糖、1%红茶的茶糖水为培养基,对红茶菌发酵条件进行优化:接种量3%菌液+5%菌膜(g/100 mL)、发酵温度28℃、瓶口直径为5 cm(装液量100 mL/250 mL)。在此条件下,连续培养10 d,真菌菌落总数在发酵第3 d为最大值3.5×107 CFU/mL,发酵液糖度14.9 Brix,pH 3.54,此时,标记为Ⅰ期;细菌菌落总数在发酵第7 d为最大值5.14×108 CFU/mL,发酵液糖度13.9 Brix,pH 3.05,此时,标记为Ⅱ期。利用宏基因组技术对Ⅰ期、Ⅱ期红茶菌样品的菌群组成进行测序分析,分别得到44491、93449个非冗余基因集,经对比数据库,Ⅰ期共96.18%的序列归属到细菌(63.46%)、真菌(32.72%),细菌中主要优势菌种是Komagataeibacter xylinus(8.91%)、Komagataeibacter europaeus(8.42%)、Komagataeibacter intermedius(5.29%)、Gluconacetobacter sp.SXCC-1(5.08%),真菌中主要优势菌种是 Pichia kudriavzevii(12.37%)、Brettanomyces bruxellensis(9.42%)、Ogataea parapolymorpha(5.06%);Ⅱ期共99.97%的序列归属到细菌(96.57%)、真菌(3.40%),细菌中主要优势菌种是 Gluconacetobacter sp.SXCC-l(29.17%)、Komagataeibacter medellinensis(7.84%)、Komagataeibacter xylinus(7.58%),真菌中主要优势菌种是Brettanomycas bruxellensis(1.86%)、Ogataea parapolymorpha(0.90%)、Pichia kudriavzevii(0.32%)。通过Alpha多样性指标(Shannon,Chaol)对样品之间的差异性进行分析,Shannon 从Ⅰ期9.53到Ⅱ期 8.54,Chaol 从Ⅰ期 49427到Ⅱ期 91300,结果表明:红茶菌样品的菌群组成发生较大变化,Ⅰ期菌群均匀度要高于Ⅱ期,而Ⅱ期菌群的物种总数要高于Ⅰ期。对宏基因组进行功能注释及代谢通路分析,以BLAST(E-value<1.0e-5)将Unigene与各数据库进行比对,Ⅰ期含有327类代谢通路,其中有548个Unigene参与氨基酸代谢过程;Ⅱ期含有338类代谢通路,其中有2475个Unigene参与氨基酸代谢过程。同时,还检测到26种次生代谢途径、115种关键酶与红茶菌次生代谢产物相关。分别收集培养3d(Ⅰ期)和7d(Ⅱ期)的红茶菌,将其混合得到菌泥,再配以保护剂(海藻糖+甘油1:1):菌泥为3:1;平衡时间40 min,真空干燥时间24 h条件下,采用真空冷冻干燥技术制备成直投式红茶菌菌粉,菌粉的存活率为78.24%。对直投式菌粉发酵液成分进行分析,选用AA-6800型氨基酸自动分析仪分析表明:发酵7 d的菌粉发酵液中人体必须氨基酸的缬氨酸、苯丙氨酸比原培养基含量增加,发酵第7 d时产生了两种新的氨基酸:组氨酸和精氨酸,组氨酸是儿童必须氨基酸,可减轻肾原性贫血;精氨酸作为半必需氨基酸,可防止血氨过高。选用LC-10A型高效液相色谱仪对草酸、琥珀酸、苹果酸、乳酸、乙酸及葡萄糖酸进行测定,有机酸总含量从4.05 g/L上升至10.78 g/L,其中葡萄糖酸含量最高6.13g/L,乙酸含量2.80 g/L。