论文部分内容阅读
目的还贝止咳方来源于临床经验方,主要用于治疗咳嗽变异性哮喘、喘息性支气管炎等肺热咳嗽,临床症状表现为久咳;为了阐明其药效及作用机制,本研究在确定提取工艺的前提下开展了止咳、祛痰、平喘、抗菌及抗过敏等药效学实验,并对其进行全面系统的探讨,从而初步明确其治疗咳嗽变异性哮喘的作用机制,为还贝止咳方的临床使用及新药的研发奠定基础。方法通过文献研究,对还贝止咳方中各味药的化学成分及药理作用进行总结,结合临床实践,拟定两条提取工艺路线,以成分结合药效学指标综合评价工艺路线,进而采用正交试验设计对还贝止咳方的提取工艺参数进行优化。采用小鼠氨水引咳、豚鼠枸橼酸引咳、小鼠酚红祛痰、大鼠毛细管排痰、豚鼠混合组胺引喘的方法对还贝止咳方的止咳、祛痰、平喘的药效学进行研究;通过鼻腔滴入肺炎链球菌,建立大鼠肺热模型,观察还贝止咳方对肺热模型大鼠的胸腺、脾脏指数,肺灌洗液中炎性细胞及炎性因子的影响;采用OVA引诱豚鼠导致的咳嗽变异性哮喘模型,在整体水平上检测与咳嗽变异性哮喘导致的咳嗽反应、炎性因子及免疫相关的指标变化,初步探讨还贝止咳方治疗咳嗽变异性哮喘的作用机制。同时,基于核磁（1H-NMR）代谢组学技术,对咳嗽变异性哮喘豚鼠结扎的右侧中叶肺组织进行检测,根据相应的S-plot及其VIP值,并结合t检验结果,寻找与还贝止咳方干预咳嗽变异性哮喘豚鼠模型相关的内源性差异代谢物,根据KEGG数据库、前期的相关动物实验结果以及相关文献挖掘其生物意义,找出其潜在生物标志物及相关代谢通路,进一步探明还贝止咳方治疗CVA的作用机制。结果1.提取工艺的研究以出膏率、总黄酮含量、绿原酸和贝母素乙含量及止咳平喘药效为指标,对两种提取工艺路线进行筛选,最终确定提取工艺为全方水提;采用L9（34）正交试验设计对加水量、煎煮次数、煎煮时间等影响水提取的主要因素进行优化,最终确定提取工艺为加10倍量水,煎煮3次,每次1.5h。2.主要药效学（1）止咳、祛痰、平喘作用还贝止咳方组对小鼠及豚鼠均具有显著的止咳作用（P<0.05）,但还贝止咳方组的豚鼠潜伏期延长时间少于阳性西药组（咳必清）,且差异显著（P<0.05）,说明还贝止咳方组对延长豚鼠咳嗽潜伏期的疗效不如阳性西药。还贝止咳方不同剂量组对小鼠及大鼠均能够显著增加气管的痰液分泌量（P<0.05）,且祛痰作用与阳性药相当。与模型组相比,还贝止咳方组均能明显延长豚鼠引喘潜伏期（P<0.05）。还贝止咳方组与小儿肺热咳喘颗粒组、氨茶碱组比较,均可延长豚鼠的引喘潜伏期,且还贝止咳方组延长豚鼠引喘潜伏期时间均短于阳性药组,且差异有统计学意义（P<0.05）,表明还贝止咳方平喘作用不如阳性药组。（2）抗炎作用与空白组比较,模型组大鼠肺组织肺泡腔内可见水肿液,肺泡壁血管充血增厚,胸膜下有数个小灶状炎细胞浸润,形成小脓肿,且模型组大鼠的体温明显升高,说明模型复制成功。与模型组比较,还贝止咳方不同剂量组大鼠全血中的白细胞、嗜中性粒细胞数目及Th/Ts比值均显著降低（P<0.05）,大鼠BALF中的IL-1β、IL-4、TNF-α、IL-6的水平明显降低（P<0.05）。（3）抗OVA诱发豚鼠CVA模型的作用与空白组比较,模型组的支气管粘膜形成皱襞,间质大量炎性细胞浸润（以嗜酸性粒细胞浸润为主）,提示CVA模型复制成功。豚鼠经辣椒素引咳后,与模型组比较,还贝止咳方组的潜伏期及5min内的咳嗽次数均有显著差异（P<0.01）;还贝止咳方组与小儿肺热咳喘颗粒组、醋酸地塞米松组比较,潜伏期及咳嗽次数均无显著性差异（P>0.05）。胸腺指数和免疫指数也有不同程度的升高趋势。通过对豚鼠BALF中的炎性因子及炎性细胞检测,发现还贝止咳方不同剂量组对IL-5、IL-4、IL-10、IFN-γ、LTE4、NGF、TNF-α均有调节作用,与模型组比较,差异具有统计学意义（P<0.05）,其作用与醋酸地塞米松疗效相当,对IFN-γ、NGF的调节作用优于小儿肺热咳喘颗粒;还贝止咳方对豚鼠BALF中白细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等均有不同程度的调节作用。3.还贝止咳方治疗CVA豚鼠模型的作用机制综合前期动物实验和1H-NMR代谢组学结果,共筛选出24个生物标志物,包括氨基酸类（丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸）、有机酸类（乳酸、乙酸）、胺类（谷氨酰胺）、脂类（磷酸酰胆碱、鞘脂）以及其他（葡萄糖）等。这些代谢物主要参与机体的能量代谢（丙酮酸代谢和脂肪酸代谢）、氨基酸代谢（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、谷氨酸和谷氨酰胺代谢、精氨酸和脯氨酸代谢）等两大方面的代谢,对还贝止咳方治疗CVA作用机制的研究具有重要意义。结论所确定的水提工艺可最大限度保留还贝止咳方中的主要活性成分,其工艺参数合理可行。主要药效学研究表明,还贝止咳方具有显著的止咳、祛痰作用,同时具有抗菌、抗炎及调节免疫等作用。进一步基于1H-NMR代谢组学技术探讨该方干预CVA模型豚鼠可能是通过调节能量代谢、氨基酸代谢等途径发挥疗效的。上述研究为还贝止咳方的临床应用提供了实验依据,也为本处方的进一步的研发奠定基础。