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布鲁氏菌病是由布鲁氏菌感染引起的一种人畜共患传染病,临床表现多种多样,动物感染后导致妊娠母畜流产,雄性动物睾丸炎;人类感染可引起波浪热、多汗、关节肿痛、肝脾肿大等症状。不仅对畜牧业造成重大的经济损失,还严重威胁人类健康。布鲁氏菌具有多种致病因子,采取多种逃避机体免疫的机制,使它们能够在细胞内存活下来并在细胞内进行复制。巨噬细胞作为先天免疫的效应细胞,在抵御病原体入侵过程中起重要作用。然而布鲁氏菌可以逃避巨噬细胞的杀伤作用,在巨噬细胞内生存和繁殖,造成机体的慢性感染。研究表明,野生型布鲁氏菌感染抑制巨噬细胞分泌TNF-α和IL-12,还能够抑制巨噬细胞吞噬功能以及抗原提呈,从而抑制Th1细胞免疫,导致机体不能有效清除布鲁氏菌。然而与野生型相比,猪布鲁氏菌Omp25缺失突变株对巨噬细胞分泌TNF-α和IL-12的抑制作用减弱,前期研究已经证实Omp25可以抑制巨噬细胞分泌TNF-α,然而,Omp25蛋白是否可以调控巨噬细胞IL-12的产生还未见相关报道。本研究拟以Omp25重组腺病毒rAd-Omp25感染THP-1细胞,经过LPS/R848刺激,ELISA检测Omp25对巨噬细胞产生IL-12p70的影响,接着在转录水平和转录后水平检测Omp25对IL-12p35和p40的影响,通过双荧光素酶试验、Q-PCR和Western Blot确定参与调控IL-12产生的miRNAs及调控IL-12产生的信号通路。最后明确Omp25蛋白对巨噬细胞IL-12产生的调控作用和机制,为进一步阐明布鲁氏菌的免疫逃逸机制提供理论依据。研究取得如下结果:1.Omp25重组腺病毒感染THP-1细胞在细胞中稳定表达Omp25,ELISA检测结果显示,Omp25抑制LPS/R848诱导的IL-12p70产生;ELISA和Western Blot检测结果显示,Omp25抑制LPS/R848诱导的IL-12p35和p40的表达;Q-PCR检测显示,Omp25对il12A mRNA水平无影响(p>0.05),极显著下调il12B的mRNA水平(p<0.01);检测il12A(p35)和il12B(p40)启动子活性显示Omp25抑制il12B(p40)转录,但是对il12A(p35)转录无显著影响(p>0.05);检测NF-κB p65转录活性和检测IκB以及IκB磷酸化水平显示,Omp25抑制NF-κB p65信号通路的活性,Omp25抑制IκB磷酸化和NF-κB p65的入核。2.Q-PCR检测结果显示,Omp25可以诱导miR-23b、miR-21-5p和miR-155上调;ELISA和Western Blot检测结果显示,miR-23b和miR-155与Omp25对IL-12p40表达的抑制作用相关,miR-21-5p与Omp25对IL-12p35表达的抑制作用相关;双荧光素酶报告试验进一步证实,miR-21-5p和miR-23b通过分别靶向il12A和il12B的3’UTR在转录后水平调控IL-12p35和IL-12p40的表达。Western Blot检测结果显示,Omp25诱导的miR-155通过靶向TAB2抑制il12B的转录;流式细胞术和ELISA检测结果显示,Omp25通过上调PD-1抑制IL-12的表达;Q-PCR检测结果显示,阻断PD-1会抑制Omp25诱导的miR-23b、miR-21-5p和miR-155表达,表明Omp25主要通过PD-1诱导的三种miRNAs进而调控人单核/巨噬细胞中IL-12的表达。综上所述,本研究利用Omp25重组腺病毒感染单核细胞THP-1,稳定地表达了Omp25蛋白。结果证明Omp25蛋白抑制LPS/R848诱导的IL-12产生。Omp25上调单核/巨噬细胞中的miR-155、miR-23b和miR-21-5p,miR-21-5p和miR-23b通过分别靶向il12A和il12B的3’UTR在转录后水平调控IL-12p35和IL-12p40的表达,miR-155通过靶向TAB2抑制NF-κB信号途径进而在转录水平抑制il12B的转录;Omp25可通过激活PD-1信号上调miR-23b、miR-21-5p和miR-155水平进而抑制LPS/R848诱导的IL-12表达。