复杂的生物学过程离不开蛋白水解酶的参与。半胱氨酸组织蛋白酶(cathepsin)是一类存在于溶酶体内的酸性蛋白水解酶;它们具有25号位的半胱氨酸活性位点(Cys25),包括多种亚型,几乎在所有的生命体中都有表达,独立而又共同地参与蛋白水解、免疫调节和癌症转移等一系列关键的生理和病理过程;Cathepsin的定量和酶活性测定方法的建立一直是肿瘤和免疫学研究中必不可少的先行研究内容。针对cathepsin的检测方法从早期的基因工程手段、蛋白组学手段,通过基因敲除、蛋白免疫印迹等方式,从蛋白质组学的整体水平对cathepsin进行功能性的研究。到现在发展的基于酶底物水解的策略和基于酶活性标记的策略,通过荧光成像等方式对活性酶进行活性评价和原位示踪,深入理解了 cathepsin活性调节和生物功能,大大推动了 cathepsin的化学生物学研究。但是,这些方法对于cathepsin家族不同亚型酶的准确含量测定以及酶活性评价在准确度和灵敏度上稍显不足,迫切需要建立一种能够对cathepsin特异性靶向识别、不同亚型含量测定和活性评价的分析检测新方法,这对于深入挖掘cathepsin含量与活性之间的相互关系以及cathepsin家族在某一具体生理或病理过程中不同亚型之间的协同/拮抗相互作用具有重要意义,并进一步为疾病诊断和理解相关生物学机制提供有力依据。在本硕士论文研究中,我们发展了基于酶活性的cathepsin特异性靶向标记策略,建立了针对cathepsin具有特异性靶向荧光成像和ICPMS绝对定量的二维检测分析方法;实现了对细胞内cathepsin的荧光成像定位、ICPMS绝对定量和酶活性评价。此外,创新性地将所发展的方法用于细胞溶酶体内环境pH的测定,为深入了解cathepsin相关生理作用机制开辟了新途径。本硕士论文的主要内容包括以下四个部分:第一章主要介绍了cathepsin的相关背景知识,包括其结构、催化机制和主要功能;对cathepsins的常用分析检测方法的优势和不足进行了归纳和概述。在此基础上提出本论文的选题依据,研究内容和研究意义。第二章设计制备了炔基化修饰的环氧抑制剂(Epoxy-Lys-AK),作为cathepsin靶向探针,特异性地与cathepsin的Cys25共价结合,发展了基于酶活性抑制原理的cathepsin靶向标记策略。进一步利用绿色荧光标签BODIPY和元素标签N3-DOTA-Eu作为报告基团,实现了cathepsin特异性荧光成像和ICPMS定量分析。第三章利用所设计合成的靶向酶活性探针Epoxy-Lys-BODIPY实现了活细胞内cathepsin的荧光成像定位,观察cathepsin在细胞内的分布。以点击反应为桥梁,实现了特异性的cathepsin镧系元素铕标记,利用HPLC-ICPMS联用技术结合同位素稀释方法实现了正常肝细胞和肝癌细胞中cathepsin B,S,L的表达含量和生物活性的检测。以环氧基团为核心的抑制剂与cathepsin之Cys25反应的pH依赖关系使得我们还可以应用此方法来探测细胞溶酶体内环境的pH值。第四章总结了本论文的研究工作。对所开展的基于酶活性小分子探针的cathepsin ICPMS绝对定量、活性评价研究进行了展望。