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三七（Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen）是我国传统的名贵中药材,主要产于云南省文山地区。三七独特的生长环境极容易诱发病虫害,尤其是真菌病害,其中主要由茄腐镰刀菌（Fusarium solani）引起的根腐病是三七的主要病害,严重影响了三七原药材的产量和品质。三七的抗病遗传育种研究鲜见报道,因而迫切需要加强三七与根腐病等病害的分子互作机制研究,发掘和克隆响应病原菌入侵的防卫相关基因,为三七的抗病育种提供理论基础。Dirigent（DIR）基因编码的蛋白能催化木质素单体耦合,参与木质素和木脂素合成过程,是植物防卫反应的重要组成部分。本研究基于三七受茄腐镰刀菌侵染后的转录组测序获得的DIR表达序列标签（expressed sequence tag,EST）,通过cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）技术从三七中克隆得到7个DIR基因全长cDNA序列,并利用生物信息学分析这7个基因及其编码蛋白质的特征。通过实时定量逆转录PCR（Quantitative real-time reverse transcriptase PCR,qRT-PCR）检测这些基因的表达特性。本文还构建PnDIR1基因的原核表达载体,诱导、纯化得到重组蛋白,通过体外平板抑菌实验检测重组蛋白的抑菌活性;构建PnDIR1的亚细胞定位载体,利用激光共聚焦显微镜检测PnDIR1在细胞内的定位。最后构建了PnDIR1的植物超表达载体,通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导转化模式植物烟草（Nicotiana tabacum）,对获得的转基因烟草进行了相关基因的表达量分析,并利用Syros法测定转基因烟草中的木质素积累量,还分析了PnDIR1转基因烟草的抗病性。本论文的研究工作及得到的主要结果如下:1.利用RACE技术从三七中克隆得到7个DIR基因的全长cDNA序列。生物信息学分析发现,这些基因都是典型的DIR基因。系统进化树分析显示只有PnDIR1属于DIR-a亚家族,其他6个基因都属于DIR-b/d亚家族。基因表达谱分析表明,7个基因都响应茄腐镰刀菌的侵染,基因表达量出现上调;除了PnDIR5,其他基因都对水杨酸（salicylic acid,SA）、乙烯（Ethylene、ETH）、茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate,MeJA）和H2O2四种信号分子的处理作出应答;PnDIR5对SA的处理没有明显的反应,而对ETH、MeJA和H2O2的处理反应明显。PnDIR1和PnDIR3均能积极响应4种信号分子处理,表达量上升。2.构建原核表达载体pET-32a-PnDIR1,转入大肠杆菌BL21（DE3）。在1 mM IPTG在28℃、200 rpm条件下培养7h,诱导重组蛋白的表达。PnDIR1重组蛋白分子量约为38 kDa,经镍柱纯化的蛋白纯度均很高,没有杂蛋白。体外平板抑菌实验结果显示重组蛋白对四种病原真菌串珠状赤霉菌（Gibberella moniliformis）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、茄腐镰刀菌（F.solani）和尖孢镰刀菌（F.oxysporum）的菌丝生长有明显的抑制作用,且随着蛋白浓度的提高,抑制活性增强。3.构建亚细胞定位载体pBIN m-gfp5-ER-PnDIR1,转化根癌农杆菌EHA105,侵染洋葱表皮细胞,共培养两天后通过激光共聚焦显微镜检测PnDIR1-GFP融合蛋白的定位。结果绿色荧光特异性分布在细胞壁上,表明PnDIR1蛋白定位于植物细胞壁。4.构建植物超表达载体pCAMBIA2300S-PnDIR1,转化根癌农杆菌LBA4404。通过叶盘转化法获得转基因烟草,利用套袋自交获得T2代转基因烟草。qRT-PCR结果表明PnDIR1在T2代转基因烟草中稳定表达,转基因烟草中木质素和木脂素生物合成相关基因的转录水平较WT提高,尤其是D7株系中NtSAD2的表达量比WT高了26.4倍,D13株系中NtP450的表达量比WT高出37倍。与此同时,转基因烟草内的木质素含量较WT也有所提高。用茄腐镰刀菌接种烟草叶片及根部,PnDIR1转基因烟草的抗性都大大高于WT,表明PnDIR1的过表达显著增强了转基因烟草对茄腐镰刀菌的抗性。综上所述,三七DIR基因家族响应茄腐镰刀菌的侵染和逆境胁迫相关信号分子的处理,参与三七抵御茄腐镰刀菌的防卫反应,是三七防御系统的重要基因。其中PnDIR1响应茄腐镰刀菌侵染和茉莉酸甲酯等几种防卫相关信号分子的处理,PnDIR1定位在细胞壁,原核表达获得的重组蛋白对串珠状赤霉菌、核盘菌、茄腐镰刀菌和尖孢镰刀菌的生长有明显的抑制作用。PnDIR1在烟草中过表达上调了木质素、木脂素生物合成相关基因的表达量,提高了木质素的积累量并增强烟草对茄腐镰刀菌的抗性。对三七DIR基因家族的克隆及PnDIR1的功能分析揭示了DIR基因家族参与三七与茄腐镰刀菌的分子互作,为深入探讨三七的抗病防卫分子机制奠定了基础,同时也为植物抗病基因工程提供了候选基因。