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肾性贫血(Renal anemia,RA)是慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)患者的主要并发症之一,并且是加重慢性肾脏疾病进展、影响肾脏病预后的重要指标,有资料显示,在CKD1期,贫血率已达19.23%,CKD3-5期普遍存在贫血,尤其在CKD5期,达到约95%,明显高于欧美CKD同期患者,且多表现为正细胞正色素性贫血,肾功能恶化程度与贫血的发病率呈正相关,目前,重组人促红细胞生成素(rhu-EPO)治疗肾性贫血取得了较好的效果,由于CKD贫血患者常存在一定程度的铁缺乏,故达标率仍然很低。研究证明,充分纠正体内的铁代谢异常,既可以显著提高rhu-EPO的治疗效果,又可以明显减少其用药剂量。而铁调素(hepcidin)是维持机体铁稳态的重要调节因子,BMP/SMAD信号通路是调控铁调素表达的主要分子机制。另外,应用外源性EPO及铁剂治疗RA会产生血粘度增加、高血压等副作用,故中医药治疗RA恰好弥补了这方面的不足,RA中医病机本虚证以脾肾阳虚多见,故本研究建立RA大鼠模型,探讨温肾益髓生血方对RA的作用机制,为该方治疗RA提供实验依据。目的:本研究采用单侧肾切除与腺嘌呤灌胃的方法制备RA大鼠模型,观察温肾益髓生血方对RA大鼠的药效学影响以及氧化应激水平的影响,应用HE染色、Mallory染色观察大鼠肾脏病理损害情况,应用原位杂交技术、Real time PCR技术、免疫组化技术、Western Blot等实验方法检测温肾益髓生血方对肾性贫血大鼠肝组织中BMP6、Smad4、Smadl/5/8、p-Smadl/5/8、hepcidin mRNA 及蛋白表达水平的影响。方法:1肾性贫血大鼠模型的制备及治疗:56只雄性,SPF级、Wister大鼠,适应性饲养1周,按体质量分层随机分组,分为正常组10只、假手术组10只及造模组36只;造模组大鼠第2周行左侧肾切除手术,假手术组仅剥离肾脏包膜、不切除肾脏,手术后恢复性饲养2周,将造模组大鼠按体质量分层随机分为模型组、尿毒清组及温肾生血组。模型组和各治疗组每天上午给予180mg/Kg·d腺嘌呤灌胃,下午治疗组给予相应的治疗药物,正常组、假手术组和模型组给予等体积的去离子水灌胃,灌胃剂量为lml/100g,同时密切观察动物饮食、饮水、行为等一般情况,每周称量大鼠体质量,治疗12周后,取材,留取肾组织及肝组织。2相关血液指标检测:各组大鼠经股动脉取血,分离血清检测肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)水平,血 Ca2+、P3+、Fe3+含量,血清 NO、MDA、SOD 含量,另一部分取全血测红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)水平。3 HE染色及Mallory染色:观察大鼠肾脏病理形态学变化。4 原位杂交、RealtimePCR:检测大鼠肝组织 BMP6、Smad4、Smadl/5/8、hepcidin mRNA表达水平。5 免疫组化、Western Blot:检测大鼠肝组织 BMP6、Smad4、Smadl/5/8、p-Smadl/5/8、hepcidin蛋白表达位置及表达水平。6数据分析:所有的实验数据应用SPSS 22.0进行统计分析。结果:1温肾益髓生血方对RA大鼠药效学的影响与模型组比较,温肾生血组大鼠一般状态明显改善;与正常组和假手术组比较,模型组大鼠随着实验天数的增加体质量呈下降趋势(P<0.01),血清BUN、Scr水平显著升高(P<0.01),且肾脏病理损害程度逐渐加重;RBC、HGB水平显著下降(P<0.01);血清Ca2+、Fe3+含量显著下降,P3+含量明显升高(P<0.01);与模型组比较,温肾生血组血清BUN、Scr水平明显降低(P<0.01),RBC、HGB 水平升高(P<0.01);血清Ca2+、Fe3+含量显著升高,P3+含量明显降低(P<0.01)。2温肾益髓生血方对RA大鼠血清氧化应激水平的影响与正常组及假手术组比较,模型组大鼠血清中NO、SOD含量显著降低(P<0.01),MDA含量显著升高(P<0.01);与模型组比较,温肾生血组大鼠血清中NO、SOD含量显著升高(P<0.01),MDA含量显著降低(P<0.01)。3温肾益髓生血方对RA大鼠肝组织BMP6、Smad4、Smadl/5/8、hepcidin mRNA表达的影响原位杂交:正常组及假手术组肝组织表达少量BMP6、Smad4、Smadl/5/8、hepcidin mRNA,明显低于模型组(P<0.01);与模型组比较,温肾生血组BMP6、Smad4、Smadl/5/8、hepcidin mRNA表达明显减少,具有显著性差异(P<0.01)。Real time-PCR:与正常组及假手术组比较,模型组大鼠肝组织表达大量BMP6、Smad4、Smadl/5/8、hepcidin mRNA,具有显著性差异(P<0.01);与模型组比较,温肾生血组大鼠肝组织BMP6、Smad4、Smadl/5/8、hepcidin mRNA表达明显减少,具有显著性差异(P<0.01)。4温肾益髓生血方对RA大鼠肝组织BMP6、Smad4、Smadl/5/8、p-Smadl/5/8、hepcidin蛋白表达的影响免疫组化:正常组及假手术组肝细胞质表达少量BMP6、hepcidin蛋白,明显低于模型组(P<0.01);与模型组比较,温肾生血组BMP6、hepcidin蛋白表达减少(P<0.01);正常组及假手术组肝细胞质及细胞核少量表达Smad4、Smadl/5/8、p-Smadl/5/8蛋白,明显低于模型组(P<0.01);与模型组比较,温肾生血组Smad4、Smadl/5/8、p-Smadl/5/8蛋白表达明显减少(P<0.01),其中,Smadl/5/8与p-Smadl/5/8的比值,各组别之间无明显差异(P>0.05)。Western Blot:与正常组及假手术组比较,模型组肝组织BMP6、Smad4、Smadl/5/8、p-Smadl/5/8、hepcidin蛋白表达显著增加(P<0.01);与模型组比较,温肾生血组肝组织 BMP6、Smad4、Smadl/5/8、p-Smadl/5/8、hepcidin 蛋白表达显著减少(P<0.01),其中,Smadl/5/8与p-Smadl/5/8的比值,各组别之间无明显差异(P>0.05)。结论:1RA模型大鼠随着造模时间增加,体质量逐渐降低,肾功下降,电解质代谢紊乱,肾脏病理改变明显,血常规各指标提示贫血,模型建立比较成功。2温肾益髓生血方可改善RA大鼠的一般状态,增加肾性贫血大鼠体质量,可以升高RA大鼠血RBC、HGB及血清Fe3+的水平,有效改善贫血。3温肾益髓生血方可升高血Ca2+,降低血清P3+水平,有效降低血清Scr、BUN、UA水平,对RA大鼠血清电解质代谢及肾功能具有一定的改善作用;温肾生血方亦可降低肾性贫血大鼠血清中MDA含量,升高NO、SOD水平,有效改善大鼠机体氧化应激状态。4温肾益髓生血方可以下调RA大鼠肝组织BMP6、Smad4、Smadl/5/8、p-Smadl/5/8、hepcidin 蛋白及 BMP6、Smad4、Smadl/5/8、hepcidin mRNA 的表达,有效纠正铁缺乏,进而改善贫血。综上,温肾益髓生血方对RA大鼠的贫血具有肯定的疗效,可能是通过BMP/SMAD信号通路影响肾性贫血大鼠肝脏hepcidin的表达,纠正铁缺乏实现的。