研究背景膀胱癌的发病率在泌尿生殖系统恶性肿瘤中位居前列,每年全世界大约有43万人被诊断为膀胱癌。如此庞大的患病人群,不仅对泌尿外科、肿瘤科等相关领域的临床和基础工作者提出了严峻的挑战,更是对经济社会发展造成了巨大的负担。因此,如何更早期准确的诊断、更精准有效的治疗成为摆在膀胱癌基础和临床工作者面前的一道难题。膀胱癌的发生、发展、对各种治疗方案的疗效反应和预后,均与其分子生物学特征密切相关。目前,膀胱癌的分子生物学研究已经进入了一个崭新的发展阶段,这得益于膀胱癌基因组学、转录组学和蛋白质组学方面基础理论的不断完善和相关实验技术的迅猛发展。目前膀胱癌的诊断仍主要依赖于膀胱镜检查,但是作为一种有创性检查,膀胱镜检查不仅给患者身体带来不可避免的痛苦,增加了患者的心理负担,而且有尿路感染、出血和尿道损伤的风险。因此,临床上急需一种创伤小、敏感性和特异性均高的无创性检查方法来协助膀胱癌的诊断。尿液脱落细胞学检查作为一种无创性的诊断方法,一开始被寄予厚望,但是由于其敏感性和特异性均不高,尚无法取代膀胱镜在膀胱癌诊断中的主导地位。随着膀胱癌分子生物学研究的不断进展,分子肿瘤标记物在膀胱癌无创性诊断中的研究也日新月异,但是目前尚无一种标记物被指南推荐可以取代膀胱镜检查的地位,仍需更多更加深入细致的基础和临床研究来寻找和筛选理想的膀胱癌分子标记物。对于转移性膀胱癌等晚期患者,目前临床上的治疗以全身化疗为主,但是20多年以来膀胱癌的一线全身化疗药物主要是基于顺铂的方案,无明显进展。随着膀胱癌分子生物学研究的不断进展,膀胱癌的靶向治疗迎来了发展的新阶段。靶向治疗的目标是干扰肿瘤特异性的信号通路,其中一些靶向治疗的药物已经进入临床试验阶段。但是由于膀胱癌的多样性和个体差异,单纯一种或几种靶向药物无法有效治疗所有的晚期膀胱癌。因此,仍需更多的基础和转化研究来为临床治疗提供更多更有效的靶向药物。PNO1基因位于人染色体2p14,由7个外显子和6个内含子组成,其编码的PNO1蛋白是一种核仁蛋白。核糖体是细胞合成蛋白质的场所,被誉为“细胞的蛋白质工厂”,由大小两个亚基组成,许多蛋白都参与到了核糖体小亚基成熟的晚期阶段,其中就包括PNO1蛋白。目前有关PNO1基因的基础研究非常少,而该基因在人膀胱癌中的表达情况和作用机制,目前尚无深入系统的研究。本研究力求通过研究PNO1基因在膀胱癌中的表达情况和作用机制,能为膀胱癌的分子肿瘤标记物诊断和靶向治疗提供新的、有价值的理论依据和实验基础。研究目的本研究拟通过检测PNO1基因在膀胱癌临床标本和细胞系中的表达情况,分析其与膀胱癌病理分级和临床分期的关系;拟利用RNA干扰技术靶向干扰PNO1基因,然后进行体内外实验以研究其对膀胱癌细胞生物学行为的影响,并探究可能的下游基因和相关通路。实验方法1.PN01基因在人膀胱癌临床标本和细胞系中的表达研究1.1免疫组织化学染色法检测膀胱癌标本中PN01蛋白的表达将石蜡包埋的人膀胱癌临床标本进行免疫组织化学染色,然后在显微镜下观察组织切片,进行视野拍照,并采集图像。根据显微镜下观察到的染色范围和染色程度这两个方面进行评分来判定蛋白表达情况,并研究其与肿瘤的病理分级和临床分期之间的关系。1.2实时定量PCR检测膀胱癌细胞系中PN01基因的表达首先设计合适的PCR反应所需要的引物,再提取人膀胱癌细胞系T24和5637中的RNA,同时提取对照细胞系人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1中的RNA,反转录获得cDNA,在配置完成反应体系后,进行实时定量PCR(Real-time PCR)检测,最后采用仪器自带软件进行数据分析。2.干扰PN01基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响和其下游基因及调控通路研究2.1 PN01基因的RNA干扰靶点设计、慢病毒载体构建首先以PNO1基因为模板,设计干扰靶点,再根据干扰靶点序列设计shRNA干扰序列,进行RNA干扰慢病毒载体的构建,获得携带RNA干扰靶点序列的慢病毒载体。2.2 PN01基因的RNA干扰慢病毒包装首先进行质粒转染,然后进行慢病毒收获与浓缩:收集转染后的293T细胞上清液,经高速离心等处理后收获上清,获得PNO1-shRNA慢病毒颗粒,按要求分装在病毒管中,-80℃保存。2.3 PN01-shRNA慢病毒感染5637和T24人膀胱癌细胞将GFP(绿色荧光蛋白)标记的PNO1-shRNA慢病毒和对照组病毒感染5637和T24人膀胱癌细胞,感染后72 h左右,使用荧光显微镜观察GFP的表达情况,筛选出细胞状态良好的感染效率合格组,用于下游检测。2.4检测PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞中PN01基因的表达情况(1)实时定量PCR检测mRNA水平PNO1基因敲减效率将5637和T24人膀胱癌细胞分为两个实验组:shCtrl组(阴性对照病毒感染组)和shPNO1组(PNO1基因shRNA慢病毒感染组)。然后采用实时定量PCR方法检测PNO1基因干扰后其mRNA的表达量。(2)Western Blotting检测靶点干扰后PN01基因的蛋白水平表达将5637和T24人膀胱癌细胞分为shCtrl组和shPNO1组两个实验组,然后将细胞样本裂解后提取细胞内的总蛋白,再进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹(转膜)、抗体杂交,最后行X光显影。2.5检测干扰PN01基因对5637和T24人膀胱癌细胞生长和增殖的影响(1)Cel igo细胞计数检测细胞生长将处于对数生长期的shCtrl组和shPNO1组细胞经过胰酶消化后进行铺板,每天用Celigo细胞计数仪检测一次,准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量,根据细胞计数值和时间点,绘制基于细胞计数值的细胞生长曲线和基于细胞增殖倍数的生长曲线。(2)细胞活力检测先将经过胰酶消化后处于对数生长期的shCtrl组和shPNO1组细胞悬液进行铺板、培养,然后依次加入噻唑兰(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide,MTT)和二甲基亚砜(DMSO)溶解甲瓒颗粒,最后用酶标仪检测其吸收值,进行数据统计分析。(3)细胞克隆形成检测先将处于对数生长期的shCtrl组和shPNO1组细胞经过胰酶消化后,制成细胞悬液、进行接种培养,荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照。最后用多聚甲醛固定细胞、GIEMSA染液染色,用数码相机拍照、计算克隆数。2.6流式细胞仪检测干扰PNO1基因对膀胱癌细胞凋亡的影响首先将shCtrl组和shPNO1组细胞接种于6孔板上,常规培养,诱导凋亡,于感染后第5天用胰酶消化,制成细胞悬液,再进行离心、Annexin V-APC染色,最后上机检测处于凋亡状态的细胞数量来检验PNO1基因与细胞凋亡的关系。2.7筛查PNO1基因的下游基因并进行Western Blotting验证分别提取shCtrl组和shPNO1组的总RNA,体外反转扩增后置入基因芯片中进行杂交、洗染、扫描,获得数据,筛选出有显著差异表现的基因,利用IPA(Ingenuity Pathway Analysis)分析软件对差异基因结果进行分析,初步筛查出PNO1基因调控的下游基因,并绘制出基因网络图。最后对筛查出的PNO1基因的下游基因进行Western Blotting验证。2.8研究PNO1基因的下游调控通路使用IPA基因通路分析软件,对基因芯片分析的差异基因和该软件数据库所收集归纳的800条信号、代谢通路进行整合分析,初步筛查出差异基因富集的信号通路。然后使用 PathScan(?)Intracellular Signaling Antibody Array Kit(信号通路蛋白抗体芯片)检测和比较shCtrl组和shPNO1组中信号通路关键信号分子的变化,研究PNO1基因在膀胱癌中的相关调控通路。实验步骤包括细胞裂解、孵育,与抗体检测液、HRP、化学发光试剂反应,显影成像和分析。2.9实时定量PCR检测PN01基因干扰后膀胱癌细胞系中mTOR基因的表达采用实时定量PCR方法检测PNO1基因干扰后膀胱癌细胞系中mTOR基因mRNA的表达情况,以验证mTOR通路是PNO1基因调控的下游通路。3.干扰PNO1基因对裸鼠膀胱癌移植瘤细胞增殖和凋亡的影响及机制研究3.1建立膀胱癌的裸鼠移植瘤模型将处于对数生长期的shCtrl组和shPNO1组成瘤细胞经过胰酶消化后,完全培养基重悬成细胞悬液,按照每组10只裸鼠将准备好的成瘤细胞注射至裸鼠右侧腋下的皮下组织内,仔细喂养裸鼠并观察生长状况。3.2移植瘤体积重量测量和活体成像检测每周收集两次常规观察指标的数据,包括裸鼠重量、移植瘤瘤体长短径等。在皮下注射成瘤细胞36天后进行活体成像检测,结束后处死裸鼠,取出肿瘤,拍摄裸鼠和移植瘤照片,称重、测量、整理数据。3.3免疫组织化学染色法检测移植瘤组织中Ki-67蛋白的表达情况先将瘤体组织进行石蜡包埋固定,再进行切片、脱蜡和水化处理,然后对瘤体切片进行Ki67抗体标记,经显色与封片后于显微镜下观察,拍照,然后进行数据整理和分析。3.4实时定量PCR检测移植瘤组织中Bcl-2和Bax基因的mRNA表达情况采用实时定量PCR方法检测膀胱癌移植瘤组织中Bcl-2和Bax基因的mRNA表达情况,以研究干扰PNO1基因对移植瘤组织细胞凋亡的影响。3.5实时定量PCR检测干扰PNO1基因对移植瘤组织中mTOR基因mRNA表达的影响采用实时定量PCR方法检测干扰PNO1基因对膀胱癌移植瘤组织中mTOR基因mRNA表达的影响,在体内条件下验证mTOR通路是PNO1基因调控的下游通路。4.统计分析使用SPSS 25.0对数据进行统计分析。根据数据类型选择相应的统计分析方法,计数资料选用卡方检验或Fisher精确检验,计量资料选用方差分析或t检验。以平均值±标准差表示计量资料,P<0.05为差异具有统计学意义。实验结果1.1 PN01蛋白在膀胱癌组织中均阳性表达并且与病理分级和临床分期有关免疫组化染色显示PNO1蛋白在正常膀胱组织中表达很少,而在低级别和高级别膀胱癌组织中则均阳性表达。分别按照临床分期和病理分级将膀胱癌标本进行分组对比研究,结果显示临床分期越晚,病理分级越高,PNO1蛋白的表达越高。1.2 T24和5637人膀胱癌细胞中PN01基因的mRNA表达升高采用实时定量PCR方法检测了 T24和563 7这两种膀胱癌细胞中PNO1基因的mRNA表达量,通过与人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1中PNO1基因的mRNA表达量进行对比分析,结果显示在T24和5637细胞中PNO1基因均有高丰度的mRNA表达。2.1 PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞系的构建成功利用RNA干扰技术构建了 PNO1基因敲减质粒,经慢病毒包装、感染,从而建立了 PNO1低表达的5637和T24膀胱癌细胞系模型。2.2 PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞中PN01基因的表达明显下调(1)实时定量PCR方法检测PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞中其mRNA的表达量显著下降实时定量PCR检测结果显示,经PNO1基因shRNA慢病毒感染后,与shCtrl组相比,shPNO1组5637细胞和T24细胞中PNO1基因在mRNA水平的表达量均受到抑制,敲减效率分别达到58.6%和71.5%。(2)Western Blott i ng方法检测PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞中其蛋白表达量显著下降Western Blotting方法检测PNO1基因干扰后5637和T24人膀胱癌细胞中相应蛋白的表达量,结果显示shPNO1组中PNO1蛋白表达水平较shCtrl组显著降低,具有统计学差异。2.3 PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞的生长和增殖受到明显抑制(1)Celi go细胞计数检测细胞生长Celigo细胞计数仪观察结果显示,自扫板观察的第3天开始,shPNO1组的细胞数量开始逐渐下降,而shCtrl组细胞数量仍然持续增加,表明shPNO1组膀胱癌细胞的增殖受到明显的抑制。(2)细胞活力检测MTT法检测结果显示,shPNO1组膀胱癌细胞在酶标仪对波长490nm光的吸收率明显低于shCtrl组,提示shPNO1组膀胱癌细胞的增殖活力受到明显的抑制。(3)细胞克隆形成检测shPNO1组的克隆形成数量和平均克隆数明显低于shCtrl组,具有统计学差异,表明在5637和T24人膀胱癌细胞中,shPNO1组细胞的克隆形成能力受到明显的抑制,提示干扰PNO1基因对膀胱癌细胞增殖有抑制作用。2.4 PN01基因干扰的5637和T24人膀胱癌细胞的细胞凋亡率明显增加流式细胞仪检测结果显示,shPNO1组的细胞凋亡率明显高于shCtrl组,具有统计学差异(p<0.01)。这表明在5637和T24人膀胱癌细胞中,shPNO1组的细胞凋亡数量增加,提示PNO1基因有抑制膀胱癌细胞凋亡的作用。2.5基因芯片联合IPA分析初步筛查出PNO1基因的下游基因采用基因芯片技术初步筛选出了在shCtrl组和shPNO1组中基因表现有显著差异的基因,结果显示,与shCtrl组相比,shPNO1组的上调基因数有675,下调基因数868。然后在IPA数据分析软件中输入基因芯片分析的差异基因结果,初步筛查出了 PNO1基因调控的下游基因CD44,PTGS2,CCND1,CDK1,F3,CXCL8 和 FOSL1。2.6 Western Blotting验证后确定PN01基因的下游基因Western Blotting方法检测结果显示,与shCtrl组相比,shPNO1组中除F3蛋白外,CD44蛋白、CCND1蛋白、FOSL1蛋白、PTGS2蛋白、CDK1蛋白和CXCL8蛋白表达均显著下调。这提示PNO1基因在T24膀胱癌细胞通过调控CD44,PTGS2,CCND1,CDK1,CXCL8 和 FOSL1 基因发挥作用,F3 基因则被排除。2.7 PNO1基因通过mTOR通路调控膀胱癌细胞的增殖通过IPA分析软件整合分析基因芯片分析的差异基因和该软件数据库所收集归纳的信号通路,初步筛查出包括mTOR信号通路在内的十大信号通路。然后使用抗体芯片检测,结果显示shPNO1组中的多个信号通路关键蛋白均下调,其中mTOR和p70 S6激酶的表达水平显著下调,具有统计学意义。这提示PNO1基因通过调控mTOR、p70 S6激酶所在的mTOR信号通路进而对膀胱癌细胞的增殖产生影响。2.8 PN01基因干扰后膀胱癌细胞系中mTOR基因mRNA的表达下调实时定量PCR检测结果显示,PNO1基因干扰后5637和T24膀胱癌细胞中shPNO1组的mTOR基因mRNA的表达量明显低于shCtrl组。3.1干扰PNO1基因可抑制T24人膀胱癌裸鼠移植瘤的生长定期观察shCtrl组和shPNO1组裸鼠的生长状况、测量裸鼠的体重和肿瘤大小,结果显示,随着时间的延长,两组移植瘤模型之间肿瘤体积的差距逐渐加大。shPNO1组的肿瘤体积和肿瘤重量均明显小于shCtrl组,表明体内条件下抑制PNO1基因的表达,可导致膀胱癌细胞在体内增殖速度减低,同时致瘤能力也受到抑制。3.2活体成像显示干扰PN01基因后T24人膀胱癌裸鼠移植瘤的生长受到抑制对两组裸鼠进行了活体成像检测,获得了每只实验裸鼠的区域内总荧光表达量等相关观察指标。结果显示shPNO1组的区域内总荧光表达量为明显低于shCtrl组,具有统计学差异,提示干扰PNO1基因可在体内条件下抑制膀胱癌细胞的增殖和移植瘤的生长。3.3干扰PNO1基因后移植瘤中Ki67蛋白表达明显下调利用免疫组化染色法对裸鼠移植瘤瘤体组织中细胞增殖标记物Ki67蛋白表达情况进行了对比分析,结果显示shPNO1组瘤体组织中Ki67阳性细胞百分比明显低于shCtrl组,表明干扰PNO1基因会使膀胱癌细胞在体内的增殖受到抑制。3.4干扰PNO1基因后移植瘤组织中Bcl-2基因mRNA表达下调,Bax基因mRNA表达升高实时定量PCR结果显示,与shCtrl组相比,shPNO1组瘤体组织中Bcl-2基因mRNA表达下调,Bax基因mRNA表达升高,提示干扰PNO1基因可在体内条件下促进细胞凋亡。3.5干扰PN01基因后移植瘤组织中mTOR基因mRNA表达下调实时定量PCR结果显示,shPNO1组瘤体组织中mTOR基因mRNA表达量明显低于shCtrl组,提示在体内条件下PNO1基因通过调控mTOR通路对移植瘤的生长增殖产生影响。实验结论1.在人膀胱癌临床标本和细胞系中,PNO1基因均阳性表达,并且肿瘤的临床分期和病理分级越高,PNO1蛋白的表达量也越高。2.体外实验中干扰PNO1基因后膀胱癌细胞的生长状况、细胞活力和克隆形成能力均受到显著抑制,而凋亡数量明显增加,表明PNO1基因在膀胱癌中具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用。进一步的机制研究表明,PNO1基因通过调控mTOR信号通路对膀胱癌细胞的生长增殖产生影响,并且CD44,PTGS2,CCND1,CDK1,CXCL8和FOSL1等基因参与其中。3.体内实验中干扰PNO1基因后裸鼠膀胱癌移植瘤的生长状况和活体荧光表达量受到显著抑制,瘤体组织的Ki67蛋白表达水平明显降低,Bcl-2基因mRNA表达下调,Bax基因mRNA表达升高,mTOR基因mRNA表达下调,表明体内条件下干扰PNO1基因可通过调控mTOR信号通路,有效抑制膀胱癌细胞的增殖、促进凋亡。