酶的催化不专一性(enzyme promiscuity)是指，一个酶的同一个活性中心不仅能够催化天然底物反应，还可以催化不同结构的底物，甚至催化不同类型的反应发生。越来越多的证据表明，酶催化的不专一性是一种普遍现象。酶催化的不专一性不仅意味着代谢途径及代谢产物的多样性，更重要的是，它与分子进化密切相关。不专一性的酶作为进化过程中的关键节点，可以进化出高水平活性专一的酶，也可以进化出新的催化活性，而新活性的产生是新功能乃至新物种产生的分子基础。　　源于Microbacterium hydrocarbonoxydans的Mhg是一个典型的催化不专一性α/β水解酶，同时具有酰胺酶和过水解酶的催化活性。本文以Mhg为研究对象，通过蛋白质工程的方法进化其新催化活性，以揭示引发这一类α/β水解酶功能分化的关键因素;在此过程中，提出并（或）验证了一些蛋白质分子进化方法的有效性和可行性。　　一、活性中心复制法进化新酶活　　Mhg与经典酯酶PFE活性中心区域只有三个氨基酸有差异。我们对这三个位点进行了系统的取代，构建了单突变体(Y32W,W204F,L233V)，双突变体(Y32W-W204F,Y32W-L233V,W204F-L233V)，三突变体(Y32W-W204F-L233V)，发现都可以赋予Mhg不同程度的酯酶活性，且三突变体活性最高，为457U/mg，这证明通过复制活性中心赋予酶新催化活性的理念是可行的。在实验过程中我们发现酯水解新活性的获得与Mhg原始活性（酰胺水解和过水解）以及重组酶可溶性表达之间存在非常严重的trade-off。具有酯酶活性的突变体都失去了原始活性，而且重组酶几乎都以包含体形式存在。后续实验中发现突变体可溶性表达可以通过蛋白质工程方法予以恢复甚至提高（突变体Y32W-W204F-L233A的可溶性蛋白占表达总蛋白的95％）。最后，我们通过测定单位质量菌体的酶活力，发现突变体Y32W-W204F-L233A是原始模版Y32W-W204F-L233V的3.6倍，是优选的突变菌株。　　二、底物通道入口改造法进化新酶活　　基于分子对接结果的分析，对Mhg通道入口的氨基酸进行蛋白质工程改造，发现通道入口处仅仅一个位点(Leu233)氨基酸的取代，就能赋予Mhg新的酯水解活性，活性最高的L233G突变酶对经典底物pNPB的比活为2665U/mg。进一步通过动力学数据验证了“野生型Mhg结构中底物通道入口阻碍对硝基苯酚酯化合物分子进入”的推测。在此过程中，发现关键位点Leu233位置不同氨基酸的取代可以调控Mhg酰胺酶、过水解酶和酯酶三种酶活之间的相互转换，甚至分离出三种单一酶活力的突变体:L233M只具有过水解酶的活力;L233T只具有γ-内酰胺酶的活性;而L233G只具有酯酶的活性。通过底物通道入口处单一位点上不同氨基酸的取代可以便捷地调节酶的不同催化活性以及实现不同催化功能的转换，这可能是酶在进化过程中实现功能分化最经济的调控策略。更为重要的是这一发现在Mhg所在的α/β水解酶亚家族中也具有普适性。　　三、多种理性设计方法进化环氧化物水解活性　　基于结构比对与环氧化物水解机理分析，先后对Mhg尝试了催化三联体置换、Tyr残基重建、丙氨酸扫描突变、环氧化物水解酶保守区域重构建以及loop区域切割等方法，构建了一系列突变体，最后在两个位点(Phe162/Leu233)筛选了饱和突变库，遗憾的是并没有得到具有环氧化物水解能力的Mhg突变体。在环氧化物酶和其它酶催化功能转换方面需要进一步的探索研究，从而揭示其内在机制和关键因素。　　在本课题中，通过多种蛋白质工程方法的深入实践，增进了对不专一性酶分子进化过程的理解、揭示了一种酶多种功能之间相互转换的便捷调控方式，同时获得一些有工业应用价值的突变酶，也为其它酶催化功能的改造提供了新的思路和宝贵的借鉴。