目的：　　 1.前期的研究表明,镁黄长石生物活性陶瓷(akermanite),具有良好的生物力学性能,并且在模拟体液中形成骨样羟磷灰石,能够明显促进大鼠成骨细胞的增殖。对于人骨髓来源的间充质干细胞(hBMSCs),种植于镁黄长石表面的细胞的增殖和分化能力明显高于同样种植于β-TCP上的细胞。而β-TCP是现今临床上广泛使用的一种生物陶瓷材料,以上结论提示我们,镁黄长石可能会作为一种有效的新型骨替代材料并应用于临床中。但是,镁黄长石与β-TCP相比,具有能较好的促进干细胞增殖和分化的性能主要是由于何种因为造成,并不为人所知。因此,了解镁黄长石较好的生物相容性和生物传导性的因为所在,可以对于我们进一步改进生物材料更好更适应的应用临床,提供一定的理论依据。同时,虽然体外细胞分子水平生物活性评价,有利于从机理上分析材料的生物学性能；但是对于生物材料整体的评价,更有赖于动物体内的实验评价。因此我们研究的第一项目的,就是调查镁黄长石这种新型的陶瓷材料对细胞增殖分化影响的机制,并且通过动物体内实验观察其生物相容性、骨整合和骨长入能力。　　 2.无论是对于组织工程骨的构造,还是对于人体骨骼的发育和再生,细胞因子和信号通路对细胞的作用也是重要的影响因素之一。了解这些通路的作用机理及其在骨形成过程中所扮演的角色,对于我们研究骨发生发育以及于临床上促进骨形成、治疗骨发育和骨再生疾病,均具有重要意义。Wnt/β-catenin信号通路是发育过程的一个重要的调控机制,近年来的研究也表明,其在骨的生长发育过程中起着不可或缺的作用。但由于研究模型的缺乏,使得这一通路在后天骨发育,特别是软骨生成和软骨内化骨过程中的作用不甚明了。而骨折的愈合过程,历来被研究者认为是骨生长发育过程的再现,骨折模型也是研究骨后天发育的重要模型之一。因此,我们研究的第二项目的,就是利用抑制Wnt/β-catenin信号通路的小鼠骨折模型,试图了解该通路对于骨再生过程,特别是软骨发生和软骨内化骨过程的作用,希望其能够为临床治疗提供一定的理论基础。　　 方法：　　 1.制备加入相同浓度的不同材料浸提液的细胞培养基(镁黄长石与β-TCP对照),对人骨髓来源的间充质干细胞进行培养,并观察其增殖和分化。利用MTT法比较hBMSC在两种材料浸提液中的增殖能力；利用碱性磷酸酶定量法比较hBMSC在两种材料浸提液中的ALP活性;利用RT-PCR和Real Time-PCR方法比较hBMSC在两种材料浸提液中的成骨分化标志基因ALP、OPN、Col I、BSP和OCN的表达。将同样大小的多孔akermanite和β-TCP材料支架,植入新西兰大白兔的股骨髁缺损模型中,并在植入早期(8周)和晚期(16周)进行荧光染料注射并分别取材,进行硬组织切片、荧光观察、品红-苦味酸染色和组织形态计量,评价分析材料在体内的骨整合性和骨长入能力。　　 2.培养和繁殖软骨细胞中特异性抑制Wnt/β-catenin信号的转基因小鼠Col2a1-ICAT,并造成其骨折模型。在骨折后不同的时期,对其进行影像学和组织学的观察,并用番红O-快绿染色,进行组织形态学计量。并且,在骨折后5周,对小鼠愈合的胫骨进行四点弯曲力学测试,以检测其骨折愈合强度。最后,对骨折后不同时期的骨痂组织进行相关基因表达的分析,了解Wnt/β-catenin信号抑制之后骨折愈合过程中这些基因表达的改变以及对愈合造成的影响。　　 结果：　　 1.通过对于镁黄长石的体内外成骨评估,我们发现:在体外情况下,MMT细胞增值实验显示,在镁黄长石浸提液中培养的人骨髓来源的间充质干细胞(hBMSC),较相同浓度的β-TCP浸提液培养环境下,其增殖能力有所增强；另外,对不同浸提液培养条件下的hBMSC进行碱性磷酸酶(ALP)定量分析和成骨细胞标志基因(OCN,OPN,BSP)表达定量分析,同样也显示相同浓度的镁黄长石浸提液较β-TCP浸提液更能促进hBMSC向成骨方向的分化。在体内的实验中,我们对植入兔股骨缺损模型中的镁黄长石和β-TCP这两种支架材料进行了组织学的观察和组织形态学的测定,发现在植入的早期和晚期阶段,镁黄长石支架材料均具有更好的成骨能力和生物降解能力；并且在植入的晚期阶段,镁黄长石支架材料中的新骨生成率高于β-TCP。　　 2.对于Wnt/β-catenin信号通路被抑制的骨折愈合,我们发现:转基因小鼠Col2a1-ICAT的骨折愈合被明显的延迟,集中表现在愈合过程中软骨形成和软骨内骨化的减少和推后。四点弯曲力学测试也表明,在骨折后5周,转基因小鼠Col2a1-ICAT的骨折部位机械承受能力明显低于未骨折时期；而此时作为对照的野生型小鼠此时骨折部位的机械承受能力已经与未骨折时无异。同时,通过实时定量PCR,我们检测了与wnt/β-catenin信号通路、软骨细胞外基质形成、骨形成、血管形成相关的各种基因,以及骨折愈合过程中涉及到的重要转录因子的表达水平,发现在Col2a1-ICAT转基因小鼠较野生型小鼠的骨折愈合过程中,特别是软骨形成、软骨内骨化和骨化时期,这些相关基因的表达均表现出不同程度的显著差异。　　 结论：　　 1.镁黄长石材料浸提液在一定的浓度范围内与β-TCP的浸提液相比,能够更好促进hBMSC的增殖和成骨分化；离子成分的差异可能是造成其生物活性差异的重要因为。镁黄长石植入兔子体内后表现出良好的生物相容性,骨整合能力和骨长入能力,提示镁黄长石可能是一种在骨修复、再生和组织工程中很有前途的生物活性材料。　　 2.Wnt/β-catenin信号通路在软骨细胞中的特异性阻断,显著的改变了骨折修复的某些阶段,导致了骨折愈合的延迟,虽然还并无明确的证据表明是否最终会造成骨不连。具体来说,Wnt/β-catenin信号通路的特异性阻断可以造成新生血管化、早期软骨骨痂形成、软骨内骨化和晚起骨化塑形的改变和延迟,并且引起愈合后骨组织机械承受能力的降低。尽管部分数据显示,在该信号被阻断时,机体可能会产生一个负反馈来应对不良改变的发生,但这些应对并不能完全抵消通路阻断后对机体造成的影响。我们研究的结果最终证明,Wnt/β-catenin信号通路在后天骨再生过程中起着及其重要的作用；而通过了解这些作用效果,可以为临床上促进骨折愈合和治疗骨折不愈合提供一种新的思路和方法。