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在当今饲料资源匮乏且环境污染严重的情况下,降低甲烷和氮的排放量,提升反刍动物饲料能量和氮利用率,具有重要意义。在瘤胃中,革兰氏阳性菌产生的氢气、氨、乙酸等代谢产物可生成甲烷或是尿素,是造成能量损失及氮浪费问题的源头。乳酸链球菌素和溶菌酶属于抗菌肽,是抗生素的潜在替代品,两者能选择性抑制革兰氏阳性菌活性,而对革兰氏阴性菌几乎不产生抑制作用。综合乳酸链球菌素和溶菌酶的特点,可以推测两种添加剂可改善反刍动物能量和氮利用效率。本论文通过体外模拟发酵结合动物体内试验方式,探究日粮中补充添加乳酸链球菌素或溶菌酶对湖羊生长性能、氮平衡、甲烷生成、瘤胃发育、瘤胃发酵以及瘤胃微生物菌群结构的影响。本研究分为三个部分:1乳酸链球菌素和溶菌酶对瘤胃体外发酵、甲烷生成及微生物菌群的影响(1)通过体外静态模拟瘤胃发酵法研究乳酸链球菌素对瘤胃发酵参数、甲烷生成及功能菌数量的影响。采用单因素多水平试验设计,以添加5 μmol/L莫能菌素为阳性对照,乳酸链球菌素添加水平分别为0(NC,阴性对照组)、3(N-3)、9(N-9)和27 mg/100 mL(N-27)每个处理4个重复,分别于培养后的0、3、6、9、12、24 h测定产气量和甲烷产量。培养24 h后,发酵液用于发酵参数和微生物菌群数量的测定。与NC组相比,添加乳酸链球菌素和莫能菌素均能显著降低产气量和甲烷产量(P<0.05);添加乳酸链球菌素对pH值、干物质消失率(DMD)和有机物消失率(OMD)无显著影响(P>0.05);N-9处理组与NC组相比氨态氮浓度显著降低(P<0.05),而N-3和N-27组氨氮浓度没有显著变化(P>0.05);相比而言,莫能菌素处理组DMD、OMD和氨氮浓度与NC组相比均显著降低(P<0.05),而pH值与其他各处理组相比没有差异(P>0.05);与NC组相比,乳酸链球菌素各处理组和莫能菌素组乙酸浓度及乙丙比均显著降低(P<0.05),丙酸浓度显著提高(P<0.05)。功能菌方面,qPCR结果显示添加乳酸链球菌素和莫能菌素对总菌和拟杆菌门数量均无显著影响(P>0.05);与NC相比,添加乳酸链球菌素对原虫、甲烷菌、真菌和厚壁菌门数量均无显著影响(P>0.05),而莫能菌素组原虫、甲烷菌、真菌和厚壁菌门数量显著降低(P<0.05);乳酸链球菌素和莫能菌素处理均显著提高了硫还原菌和C.aminohilum数量(P<0.05),但Cstickland.数量不受影响(P>0.05)。结果表明,适宜浓度的乳酸链球菌(3mg/100mL)可以改变瘤胃发酵类型,增加丙酸浓度,显著抑制甲烷生成、降低瘤胃氨氮浓度,而不影响饲料消化,这种改变可能与功能菌群数量的变化密切相关。(2)通过体外静态模拟瘤胃发酵法研究溶菌酶对瘤胃发酵、甲烷生成及微生物菌群结构的影响。采用单因素多水平试验设计,溶菌酶添加水平分别为0(L-0,对照组)、0.1(L-0.1)、1(L-1)、10(L-10)和 100 mg/100 mL(L-100),定时测定产气量和甲烷产量,培养24 h后,发酵液用于发酵参数和微生物菌群数量的qPCR测定,其中L-0、L-1和L-100三个组发酵液同时进行16S rRNA基因Illumina高通量测序。与对照组相比,低剂量溶菌酶添加(L-0.1组)不影响甲烷产量、氨氮浓度、干物质消失率、有机物消失率和总挥发性脂肪酸等瘤胃发酵参数(P>0.05);随着剂量提高,L-1处理组甲烷产量、氨氮浓度显著降低(P<0.05),丙酸浓度显著增加(P<0.05),并且干物质消失率、有机物消失率和总挥发性脂肪酸不受影响(P>0.05);而较高剂量组(L-10和L-100组)虽然甲烷产量显著降低,丙酸浓度显著增加(P<0.05),但干物质消失率和有机物消失率也显著降低(P<0.05)。qPCR结果显示高剂量组(L-100组)总菌、原虫、甲烷菌数量与对照组相比显著降低(P<0.05),而L-0.1、L-1和L-10组总菌、真菌和原虫数量与对照组相比均无显著变化(P>0.05)。高通量测序主成分分析(PCA)显示对照组与溶菌酶添加组间瘤胃细菌的组成区分明显,说明添加溶菌酶显著改变了瘤胃细菌菌群结构。溶菌酶通过增加月形单胞菌和琥珀酸弧菌等丙酸生成菌的相对丰度,使更多的氢被用于生成丙酸,导致甲烷产量降低;溶菌酶可抑制普雷沃氏菌和拟杆菌属等蛋白降解菌的生长,进而减少蛋白质过度降解,降低氨氮浓度。添加适宜浓度(1 mg/100 mL)的溶菌酶可通过调控瘤胃微生态改变瘤胃发酵模式,降低瘤胃甲烷和氨的生成,短期内并不影响饲料消化。2乳酸链球菌素和溶菌酶对湖羊生长性能、瘤胃发酵和氮平衡的影响本试验根据体外模拟发酵试验结果,通过体内试验研究乳酸链球菌素和溶菌酶对湖羊生长性能、瘤胃发酵和氮平衡的影响。试验选取36只2月龄公湖羊(22.8 ± 1.79 kg),按随机区组设计和同栏大小相近原则,根据体重分为3个处理,分别为对照组,乳酸链球菌素组和溶菌酶组,每组分为4栏,每栏饲养3只羊。试验分为两期,1-6周为第1期,7-12周为第2期。对照组两期均饲喂基础日粮,乳酸链球菌素组第1期和第2期在饲喂基础日粮的基础上每只羊每天分别添加450 mg和1350 mg乳酸链球菌素,溶菌酶组第1期和第2期在饲喂基础日粮的基础上每只羊每天分别添加100 mg和500 mg溶菌酶。结果发现,乳酸链球菌素组干物质采食量显著高于对照组(P<0.05),而添加溶菌酶对干物质采食量无显著影响(P>0.05)。日粮中添加乳酸链球菌素或溶菌酶对湖羊体重、饲料转化效率及养分消化率均无显著影响(P>0.05);添加乳酸链球菌素和溶菌酶显著降低瘤胃氨氮、异丁酸及总支链挥发性脂肪酸浓度(P<0.05),但对瘤胃总VFA、乙酸、丙酸、丁酸以及乙丙比均无显著影响(P>0.05);与对照组相比,乳酸链球菌素和溶菌酶组中氮沉积量(g/d)和氮沉积率(沉积量/摄入量)数值高于对照组,但均无显著差异(P>0.05)。试验结果表明日粮添加乳酸链球菌素和溶菌酶可提高湖羊干物质采食量,改善瘤胃发酵,减少支链挥发性脂肪酸和氨氮生成,并对湖羊氮代谢有改善作用。3乳酸链球菌素和溶菌酶对湖羊瘤胃发育、瘤胃发酵及微生物菌群结构的影响本章试验在第二章的基础上,通过屠宰方式获取瘤胃样品,探究乳酸链球菌素和溶菌酶对瘤胃发育、瘤胃发酵以及微生物菌群结构的影响。结果显示,乳酸链球菌素和溶菌酶的添加能显著增加肝脏重量(P<0.05),但对瘤胃乳头发育无显著影响(P>0.05)。与对照组相比,乳酸链球菌素和溶菌酶的添加对pH值、总VFA、乙酸、丙酸、挥发性支链脂肪酸浓度和乙丙比等瘤胃发酵参数均无显著影响(P>0.05),但氨氮浓度显著降低(P<0.05)。qPCR结果显示总菌、真菌、原虫和甲烷菌数量等均不受乳酸链球菌素或溶菌酶添加的影响(P>0.05);在乳酸链球菌素组和溶菌酶组中,高效产氨菌C.aminophilum数量低于对照组,但无显著差异(P>0.05),而另一种高效产氨菌C.sticklandii未被检出。高通量测序结果表明,与对照组相比,溶菌酶组中微生物shannon指数显著升高(P<0.05),而乳酸链球菌素组中无显著变化(P>0.05)。经过瘤胃微生物菌门、菌属以及OTU水平的多重分析比较,得出日粮中添加乳酸链球菌素或溶菌酶对瘤胃微生物菌群组成分布与对照组无显著差异;乳酸链球菌素组和溶菌酶组与对照组相比可以显著降低甲烷球形菌属(Methanosphaera)相对丰度(P<0.05),而对优势菌属中主要的纤维降解菌和蛋白降解菌相对丰度无影响。综上所述,乳酸链球菌素和溶菌酶在对优势菌属中主要的纤维降解菌和蛋白降解菌无显著影响的条件下,显著增加肝脏重量、显著降低氨氮浓度及甲烷球形菌属相对丰度,这些变化与促进能量和氮元素利用率提高有关。