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目的与背景:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常见的慢性神经退行性疾病,在AD病变中钙蛋白酶过度活化,加剧AD疾病进展。因此,抑制钙蛋白酶对治疗AD具有重要意义,但因钙蛋白酶种类繁多,参与多种生理活动。目前尚无特异性的钙蛋白酶抑制剂。因此,本研究采用RNAi沉默CAPN1基因,利用Aβ25-35诱导的AD样细胞模型,观察RNAi沉默CAPN1表达对Aβ25-35诱导的原代皮层神经细胞的神经毒性及凋亡的影响。方法:实验分组:1)原代胎鼠皮层神经元+PBS;2)原代胎鼠皮层神经元+阴性参照毒液+10μM Aβ25-35;3)原代胎鼠皮层神经元+CAPN1 shRNA慢病毒+10μM Aβ25-35;4)原代胎鼠皮层神经元+CAPN1 shRNA慢病毒+10μM Aβ25-35+2ug/ml p25;各组转染慢病毒48小时后,再加各种药物,再培养72h。CCK-8法检测神经元细胞活力的变化情况,Annexin V-PI方法进行细胞凋亡检测,Real-Time PCR检测转染CAPN1 RNAi后CAPN1 mRNA的表达水平,Western blotting检测μ-calpain,CDK5,GSK-3β,p-tau/tau蛋白表达的变化。结果:(1)CCK8检测结果显示,与NC对照组相比,NC+Aβ组细胞活力显著下降,转染CAPN1 shRNA后细胞活力有显著升高(p<0.05);与CAPN1 shRNA+Aβ组相比,CAPN1 shRNA+Aβ+p25组细胞活力无显著性差异(p>0.05);(2)Annexin V-PI凋亡实验结果表明,与NC组相比,转染CAPN1 shRNA后细胞凋亡比例显著升高(p<0.01);而转染CAPN1 shRNA后,与模型组相比,CAPN1shRNA+Aβ组凋亡率显著降低(p<0.05)。而在CAPN1shRNA+Aβ+p25组,细胞凋亡较CAPN1shRNA+Aβ组增强,但无统计学意义(p>0.05)。(3)RT-PCR检测结果表明,与NC+Aβ组相比,CAPN1 shRNA+Aβ组CAPN1 mRNA的表达显著得到抑制;shCAPN1+Aβ+p25组中mRNA表达水平较CAPN1 shRNA+Aβ组有所上调,但无统计学意义(p>0.05)。(4)western blot方法检测蛋白表达情况,结果:与NC组相比,NC+Aβ组中μ-calpain,CDK5,p-tau/tau蛋白表达水平显著升高(p<0.01),GSK-3β蛋白表达水平升高(p<0.05);而转染CAPN1 shRNA后,与NC+Aβ组模型组相比,μ-calpain,GSK-3β,p-tau/tau蛋白表达水平下降(p<0.01),CDK5蛋白表达水平降低(p<0.05);在加入P25后(CAPN1 shRNA+Aβ+P25组),CDK5,GSK-3β,p-tau/tau蛋白表达水平均有所上调,μ-calpain蛋白表达未见明显改变(p>0.05)。结论:RNAi沉默CAPN1基因,通过下调μ-calpain,可以显著改善Aβ25-35诱导的原代神经细胞的神经毒性损害,其作用机制可能是通过下调CDK5,GSK-3β激酶蛋白,p-tau蛋白表达水平来实现的。