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研究目的:探讨依他尼酸(EA)联合顺铂对A549细胞球的杀伤效应及机制。方法:1、以无血清培养基(serum-free medium,SFM)的方法诱导A549细胞形成A549细胞球。2、应用 Western blot 检测 CD133、SOX2、EpCAM 和 ABCG2 的蛋白表达水平。用1、2、5、10、20mg/ml的浓度顺铂(DDP)分别处理A549及细胞球48h后,用MTT检测细胞活力。3、应用比色法检测l0μM、50μM、100μM和200μM EA对A549细胞球中GST活性的抑制作用。应用流式细胞术检测200μM EA处理A549细胞球48h后ROS水平。4、应用CCK-8检测不同处理组(Control组、5mg/mlDDP组、200μMEA组和5mg/ml DDP+200μM EA组)干预A549细胞球后24h、36h和48h的细胞抑制率。应用流式细胞术检测不同处理组(同上)干预A549细胞球48h后的凋亡率。在细胞成球实验中观察200HM EA处理后A549细胞球的成球能力。5、应用 Western blot 和 qPCR 检测 200uM EA 处理 A549 细胞球前后β-catenin、Sox2和ABCG2的mRNA和蛋白水平;应用荧光素酶报告基因检测200uMEA处理A549细胞球前后β-catenin启动子活性的变化情况。6、用β-catenin腺病毒感染A549细胞球后,再用200μM EA的处理A549细胞球,应用 qPCR 和 Western blot 检测β-catenin、Sox2 和 ABCG2 mRNA 和蛋白的变化,并应用CCK-8检测上述处理后细胞抑制率的变化。结果:1、成功培养出悬浮的A549细胞球。2、应用Western blot检测结果显示A549细胞球高表达肿瘤干细胞标志物CD133、SOX2、EpCAM以及耐药相关蛋白ABCG2。应用MTT检测结果显示A549细胞球可耐受不同浓度DDP的杀伤作用。3、应用比色法检测结果显示GST活性随着处理组EA浓度的递增而逐渐降低。应用流式细胞术检测结果显示200μMEA处理A549细胞球后ROS水平明显升高。4、应用CCK-8检测结果显示5mg/ml DDP组、200μM EA组和5mg/ml DDP+200μM EA组在24h、36h和48h的细胞抑制率均显著高于Control组(p <0.05)。此外,5mg/mlDDP+200μMEA组在24h、36h和48h时的细胞抑制率均高于5mg/ml DDP组和200μM EA组A549细胞球在24h、36h和48h的细胞抑制率。流式细胞术检测凋亡发现5mg/mlDDP+200μMEA组、5mg/mlDDP组和2000μM EA较control组凋亡率显著升高。细胞成球实验中,EA抑制A549细胞球的成球能力。5、应用Western blot和qPCR检测结果显示EA下调了 A549细胞球的β-catenin、Sox2和ABCG2 mRNA和蛋白的表达。应用荧光素酶报告基因检测结果显示EA抑制了 β-catenin的启动子活性。6、应用qPCR和Western blot检测结果显示过表达β-catenin后,200uM EA对β-catenin、Sox2和ABCG2 mRNA和蛋白的抑制作用较空载体组显著减弱。应用CCK-8检测结果显示过表达β-catenin可显著削弱200uM EA联合5mg/ml DDP对A549细胞球的增殖抑制作用。结论:1、EA可降低A549细胞球对顺铂的耐药性,顺铂和EA的联合应用能更有效的杀伤A549细胞球。2、EA可能通过抑制GST活性,促进ROS生成和抑制β-catenin及其下游SOX2、ABCG2和β-catenin水平,发挥抑制A549细胞球增殖和干性,促其凋亡的作用。