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嗜热菌作为地球上最早形成的生命形式,对高温有惊人的适应能力。来源于嗜热菌的各种嗜热酶由于具有良好的生物稳定性和独特的催化活性而成为工业和科学研究领域所关注的焦点。本论文将分离自云南腾冲温泉的两株嗜热Bacillus sp.K91和Alicyclobacillus tengchongensis CGMCC1504 3条SGNH家族酯酶基因K91-Est8、K91-Est19和EstD1分别与pEASY-E2载体连接构建重组质粒p EASY-E2-Est8,pEASY-E2-Est19和pEASY-E2-EstD1,并将重组质粒转化到Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达。利用组氨酸标签纯化重组酶K91-Est8、K91-Est19和EstD1,并对其进行了酶学性质和催化活性位点研究,主要结果如下:(1)重组酶K91-Est8的最适pH为9.0,在pH 8.0-9.3范围内具有较好的稳定性;最适温度为50℃,在80℃和95℃仍然分别具有47.1%和22.7%的酶活,37℃时的热稳定性良好;大多数金属离子和化学试剂对其活性均有促进作用;可以水解酰基链长度为2、4、6、8的人工合成pNP底物,且对pNPC2的酶活力约是pNPC4的37倍、pNPC6的454倍、pNPC8的1428倍;能将7-氨基头孢烷酸(7-ACA)脱乙酰化。(2)重组酶K91-Est19的最适pH为9.0,在pH 8.5-9.5具有较好的稳定性;最适温度为60℃,37℃时的热稳定性良好;大部分金属离子及化学试剂对其活性无影响或影响微弱;可以水解酰基链长度为2、4、6的pNP底物,且对pNPC2的酶活力约是pNPC4的17倍、pNPC6的3000倍,对7-ACA不具有脱乙酰化作用。(3)重组酶EstD1的最适pH为8.5,具有良好的pH稳定性,即在pH 4.0-11.0下具有较好的稳定性;最适温度为65℃,37℃时热稳定性良好,50℃和65℃下半衰期约为60 min;可以水解酰基链长度为2、4的pNP底物,且对pNPC2的酶活力约是pNPC4的43倍;对7-ACA具有脱乙酰化作用。(4)从(1)-(3)可以得出这3个酶的活性疏水结合口袋更适合酰基链较短的酯类,且均较为专一性水解酰基链长度为2的底物;他们还可以水解乙酸萘酯类底物,而且对β-乙酸萘酯的催化活性要比α-乙酸萘酯的高。这些性质在SGNH家族水解酶对底物的专一性研究上具有理论意义。(5)经序列比对和同源建模分析,利用定点突变的方法证明了K91-Est8、K91-Est19、EstD1的催化活性残基分别是S11、D182、H185;S49、D227、H230和S14、D190、H193。本研究获得的3个SGNH家族酯酶K91-Est8、K91-Est19和EstD1,不仅为SGNH家族酯酶的结构和功能研究提供了良好的材料,而且在β-内酰胺类抗生素的工业合成上具有潜在的应用前景。