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研究背景及目的伤口愈合障碍是糖尿病常见的并发症。众多影响伤口愈合的因素中,血管形成障碍是一个主要的原因,这可能与高血糖所致的内皮细胞衰老加速、功能受损有关。研究表明,部分miRNA可参与内皮细胞血管形成的调节,其中miR-30家族在内皮细胞中含量较为丰富,能促进HUVECs的成血管作用,且miR-30a还可调节BJ原代人成纤维细胞的衰老。但其是否也参与了内皮细胞衰老的调节还未可知。有研究通过基因芯片检测发现,STZ诱导的糖尿病大鼠伤口组织与非糖尿病大鼠伤口组织相比,miR-30家族部分成员表达下调,但其在糖尿病伤口愈合中的作用和机制尚不明确。故本研究选择C57BL/6小鼠和HMEC-1为研究对象,以miR-30a为切入点,探讨miR-30a能否通过调节高糖诱导的内皮细胞衰老,影响糖尿病伤口的愈合。1:构建小鼠背部皮肤全层缺损伤口模型,探索糖尿病伤口组织与非糖尿病伤口组织中miR-30a的表达是否存在差异,观察miR-30a干预对伤口愈合及伤口组织衰老的影响。2:体外模拟高糖环境,观察高糖是否影响miR-30a的表达。检测高糖干预后HMEC-1中β-半乳糖苷酶和p53、p21的变化,以及细胞增殖、迁移和血管形成改变。予以miR-30a干预,观察miR-30a对高糖条件下内皮细胞衰老及生物学行为的影响。3:采用三个数据库预测miR-30a可能调控的靶基因,并通过文献查阅和免疫印迹的方法探索miR-30a抑制高糖条件下内皮细胞衰老的可能机制。研究方法1.体内实验:构建STZ诱导的糖尿病小鼠模型,构建非糖尿病小鼠与糖尿病小鼠背部全层皮肤缺损伤口模型,q RT-PCR检测伤口皮肤组织中miR-30a的表达情况。局部皮下注射miR-30a-5p agomir及其对照agomir NC。观察并计算伤口闭合率,取术后第14天的伤口组织,切片CD31染色、β-半乳糖苷酶染色观察伤口血管形成和衰老情况。2.体外模拟高糖环境,将HMEC-1随机分为如下几组干预48h:正糖组(NG:5.5mmol/L D-葡萄糖),渗透压组(OSM:5.5mmol/L D-葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇),高糖组(HG:30mmol/L D-葡萄糖)。miR-30a干预部分设三组:高糖对照组(HG:30mmol/L D-葡萄糖),agomir对照组(HG+agomir NC:30mmol/L D-葡萄糖+agomir NC),agomir干预组(HG+agomir:30mmol/L D-葡萄糖+miR-30a-5p agomir)。q RT-PCR检测miR-30a的表达。并通过Ed U、划痕、小室、成管实验和β半乳糖苷酶染色与免疫印迹检测p53与p21的表达分别观察细胞的增殖、迁移、成管和衰老情况。3.通过miRNAMap、Target Scan7.1、miRDB三个数据库预测miR-30a可能调控的靶基因,选取三个数据库共有的靶基因进行文献查阅后,筛选出3个与血管形成和细胞衰老相关的基因,进行进一步的免疫印迹分析。研究结果1.与非糖尿病组相比,糖尿病组伤口组织衰老增加,血管形成减少,伤口愈合延迟,且miR-30a-3p与miR-30a-5p的表达均下调。同时体外研究发现,高糖可抑制HMEC-1中miR-30a-5p的表达,但对miR-30a-3p的表达无显著影响。且于伤口局部过表达miR-30a-5p可抑制糖尿病所致的伤口组织的衰老,促进糖尿病小鼠伤口的愈合。2.高糖使HMEC-1中p21、p53的表达上调,促进内皮细胞衰老,使其增殖、迁移和成管能力下降。过表达miR-30a-5p可下调HMEC-1中p21的表达,显著改善高糖诱导的内皮细胞衰老,一定程度上的逆转高糖对内皮细胞增殖、迁移和血管形成的抑制作用,但对p53的表达无明显影响。3.通过miRNAMap、Target Scan7.1、miRDB三个数据库对miR-30a-5p的可能调控的靶基因进行预测,结果提示三个数据库共有的基因有26个。分别进行文献查阅,选取三个与血管形成和细胞衰老相关基因(CHD7,PRKRIR,ASK1)进行免疫印迹分析。结果:高糖及miR-30a-5p均对CHD7和PRKRIR的表达无明显影响。不同的是,高糖在抑制HMEC-1中miR-30a-5p表达的同时,上调了ASK1的表达,且过表达miR-30a-5p能抑制ASK1表达。但miR-30a-5p与ASK1之间是否存在直接的联系仍需进一步验证。结论1.糖尿病可诱导小鼠伤口皮肤组织衰老,延缓伤口愈合。其机制可能与高糖所致的内皮细胞中miR-30a-5p表达下调,从而上调ASK1的表达,促进内皮细胞的衰老有关。2.miR-30a-5p可抑制内皮细胞中ASK1的表达,抑制高糖诱导的内皮细胞衰老,改善内皮细胞的功能,从而促进糖尿病小鼠皮肤伤口的愈合。3.miR-30a-5p对高糖条件下内皮细胞衰老及其生物学行为的调控是否是通过直接靶向ASK1仍需进一步的研究。