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蜱是一种吸血的媒介节肢动物，在人和动物疾病防治领域中具有重要价值。RH36是上海兽医研究所从镰形扇头蜱唾液腺分离鉴定的一个具有免疫调节作用的蛋白，抑制宿主免疫应答反应;基因干扰实验和重组蛋白免疫实验不但发现RH36影响蜱的叮咬吸血过程，还意外发现其严重影响蜱的生殖产卵。鉴于蜱的生殖过程在蜱防控中的核心作用，因此，本研究将围绕RH36影响蜱生殖产卵的作用，探索这一功能的分子机制，为寻找蜱的防治关键靶标提供基础。 一、RH36分子的表达特征与蜱生殖发育时序的关系。 分析RH136分子结构并预测其抗原表位，利用多肽制备RH36抗体。应用RT-qPCR和Western Blot方法，研究了RH36分子在蜱吸血过程中的表达特征，发现(1)RH36在吸血蜱的唾液腺中表达，在血淋巴、脂肪体和卵巢等器官没有表达，具有器官特异性表达的特点。(2)在吸血前和吸血后的不同时间，随着吸血时间延长，蛋白表达量逐渐上升，蜱饱血时表达量达到高峰，表明RH36在蜱的吸血后期作用特征，与蜱的卵巢发育时间高度吻合。 二、RH36基因沉默对蜱卵巢发育形态学和卵黄发生的影响。 通过RNA干扰实验比较观察了RH36基因沉默后蜱的生殖系统的形态学变化，发现RH36基因敲除后卵巢发育不成熟且输卵管中成熟卵细胞量较少，导致了干扰组蜱的产卵率显著下降。分离纯化镰形扇头蜱卵黄蛋白，并制备了单克隆抗体，用于检测RH36基因敲除后蜱卵巢中卵黄蛋白的表达量，结果显示RH36基因沉默后显著抑制卵巢中卵黄蛋白的表达量;免疫荧光分析发现，RH36基因沉默组卵细胞内卵黄蛋白的储存量比对照组显著减少。这些结果显示，RH36对生殖产卵的作用，与卵巢发育和卵黄发生过程密切相关。 三、RH36基因沉默后蜱卵巢蛋白组学分析。 RH36基因沉默后，进行了蜱卵巢差异蛋白质组学分析。发现吸血第5d卵巢蛋白质组中上调蛋白数是25个，下调蛋白数是19个;饱血后第10d卵巢蛋白质组中上调蛋白数是74个，下调蛋白数是134个。通过对差异蛋白的GO功能注释和KEGG分析，发现HSP70、内吞途径和焦点黏连相关蛋白受RH36基因沉默的影响较显著，提示了RH36作用的可能途径。 四、RH36通过热激蛋白HSP70影响蜱吸血生殖的研究。 克隆HSP70家族基因，并与其它蜱种及人类热激蛋白序列比对分析发现相似性很高，说明HSP70家族基因在进化上高度保守。HSP70-5分布广泛，在吸血期和饱血期的脂肪体、血淋巴、卵巢和唾液腺中高表达;RH36基因沉默显著下调HSP70-5在吸血期和饱血期的表达。RNA干扰实验发现，HSP70-5基因沉默不仅抑制蜱的饱血，而且下调表达卵黄蛋白原和RH36蛋白。结果表明，RH36与HSP70蛋白在分子水平上相互作用，RH36可通过HSP70蛋白影响卵黄蛋白原的产生，从而影响蜱产卵。 五、RH36通过焦点黏连相关蛋白影响蜱生殖产卵的研究。 在非肌细胞中，actinin、paxillin和parvin相互作用调节细胞的黏附运动和细胞增殖。RH36基因沉默显著下调焦点黏连相关蛋白parvin、paxillin和actinin基因在饱血后卵巢中的转录水平，这与蛋白质组结果一致，说明RH36确实影响卵细胞的焦点黏连作用。RNA干扰实验发现，尽管paxillin基因沉默后对蜱的吸血和生殖性状无显著影响，但parvin和actinin基因沉默后不仅抑制蜱的饱血率、产卵率和饱血体重，而且显著阻碍饱血后期卵巢的发育成熟。同时也发现，焦点黏连相关蛋白parvin、paxillin和actinin基因沉默后，均影响RH36基因的转录，表明RH36分子与焦点黏连分子间存在相互作用。这些结果说明了RH36可能通过影响卵巢中焦点黏连相关蛋白parvin和actinin，影响卵巢的发育成熟和卵黄蛋白的表达，进而影响蜱的生殖。 六、RH36通过内吞途径影响蜱生殖产卵的研究。 RNA干扰实验发现，卵黄蛋白原受体(VgR)基因沉默后显著降低蜱的产卵率，显微解剖发现显著抑制蜱卵巢的发育成熟，而且显著下调卵黄蛋白原Vg基因的转录，证实了VgR介导的内吞途径在卵黄发生过程中的重要作用。在RH36基因沉默蜱的卵巢中，液泡蛋白分选蛋白VPS24和VPS37的蛋白质表达均显著下降。进一步RNA干扰实验发现，VPS24沉默后下调卵巢组织中卵黄蛋白原Vg基因的转录水平，而VPS37基因沉默后主要下调非卵巢组织中Vg基因的转录水平。同时，VPS24、VPS37和VgR基因沉默后均下调RH36基因的转录水平。这些结果说明蜱RH36与VgR介导的内吞途径关系密切，主要通过影响VPS24和VPS37分子在内吞途径中作用而影响蜱卵巢的发育成熟和产卵。 综上所述，本研究对镰形扇头蜱RH36分子在蜱的生殖产卵中作用及其分子机制进行了研究，发现RH36分子的表达特征与蜱的卵巢发育时间高度吻合。RH36基因沉默可导致蜱卵巢不正常发育和减少卵黄蛋白的表达。卵巢差异蛋白组学发现HSP70、内吞途径和焦点黏连相关蛋白受RH36基因沉默的影响显著。RH36可通过HSP70分子、焦点黏连相关Parvin和Actinin分子，以及内吞途径相关VPS24和VPS37分子，影响蜱的生殖发育和产卵。这一机制的解析，将有利于RH36分子在抗蜱疫苗和蜱传病防治上的开发应用。