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背景NK/T细胞淋巴瘤(NK/T cell lymphoma NKTCL)是非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma NHL)的特殊类型,发病率较低,占非霍奇金淋巴瘤的5%-18%。本病在亚洲地区如日本、中国、韩国及南美洲和中美地区发病率较高,欧洲及北美洲地区发病率较低[1]。在当前世界卫生组织分型方法里面,NK细胞肿瘤可以分做两个成熟的亚型:结外NK/T细胞淋巴瘤鼻型(entranodal NK/T-cell lymphoma,nasai type,ENKTL)以及NK淋巴细胞白血病(aggressive NK-cell leukemia,ANKL)。结外NK/T细胞淋巴瘤鼻型(ENKTL)被视为一个独特的病理亚型:多见于青壮年男性,病变常局限在上呼吸道或上消化道,包括鼻腔、鼻咽、鼻窦、口咽等,早期患者以放化疗为主,预后较好。晚期及复发患者仍以化疗为主[2]。而鼻外型病变分布位置差别较大,常发生在胃肠道、唾液腺、皮肤和睾丸。这些病例被称为“非鼻型”NK/T细胞淋巴瘤,往往进展快速,预示着他们可能是预后不同的临床类型[3]。NKTCL恶性程度高,应用常规的包含蒽环类的CHOP或CHOP-like方案敏感性较差[4]。这与其细胞高表达多药耐药基因MDR(Multi-drug resistance)相关的P-糖蛋白有关[5]。除这一机制外,是否存在其他耐药机制仍需进一步探索。吉西他滨是非P-糖蛋白依赖的化疗药物,近几年来,以吉西他滨为主的化疗方案在NKTCL的治疗上取得了较好的效果。我们河南省淋巴瘤中心首次创立的DDGP(吉西他滨、顺铂、地塞米松、培门冬酶)方案治疗NKTCL完全缓解率达到71%,总缓解率达到95%,较常规的以蒽环类为主的方案疗效有明显提高[6]。但是仍有部分患者出现原发或继发耐药导致治疗失败或疾病进展。而目前NK/T细胞淋巴瘤对吉西他滨耐药的分子机制尚无相关研究。随着生物学技术的进展,高通量测序技术在生命科学研究的各个方面已经得到非常广泛的应用。高通量测序技术的应用,提高了测序的准确性、速度与效率,同时对肿瘤诊断及治疗手段的改进也起到了促进作用。其中DGE(Digital gene expression,DGE,数字基因表达谱)是一种高通量测序技术从RNA转录水平对RNA表达进行定量检测方法,通过不同RNA的样本检测,不但可以寻找基因组中基因表达的差异,进而可以用实验验证分析出来的显著差异表达基因,从而确定有临床指导意义的差异表达基因。通过差异表达基因的功能研究对于疾病的发生发展预后,以及治疗靶点的选择都有着重要的意义。本研究拟采用高通量测序的方法,筛选、鉴定人NK/T细胞淋巴瘤中,吉西他滨敏感株与吉西他滨耐药株之间的差异表达基因,并对候选关键基因进行验证。目的筛选及鉴定人NK/T细胞淋巴瘤细胞敏感株(YTS)和耐吉西他滨细胞株(YTSR)差异表达基因,并对其候选关键差异基因进行基因及蛋白水平验证。方法Trizol法提取非耐吉西他滨的NK/T细胞淋巴瘤细胞株、耐吉西他滨的NK/T细胞淋巴瘤细胞株的RNA;高通量测序检测二者数字基因表达谱并比较差异基因的表达。采用荧光实时定量技术(QPCR)和Western Blot技术检测候选基因AQP3在两个细胞株中的表达情况,验证其在耐药细胞株中的表达。结果1、筛选出了人耐吉西他滨的NK/T细胞淋巴细胞瘤细胞株与非耐吉西他滨的细胞株之间的明显差异表达基因。其中表达上调基因142个,表达下调基因96个。2、差异基因聚类分析及功能显著性富集分析显示差异基因在MAPK及粘着小带相关通路富集明显。3、荧光实时定量技术(QPCR)和Western Blot技术检测测序结果中显著差异表达基因AQP3,其在两个细胞株中的表达与测序结果一致。结论1.耐吉西他滨NK/T细胞淋巴瘤与不耐药的NK/T细胞淋巴瘤之间存在大量的显著差异表达基因,这些差异基因富含多个通路。2.在耐吉西他滨NK/T细胞淋巴瘤细胞株中AQP3的表达明显上调,提示AQP3表达上调可能为人NK/T细胞淋巴瘤对吉西他滨耐药的机制之一。