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乳腺癌是现阶段对女性健康的一大重要危害。化疗是治疗癌症的一个最有效的方法,但是在乳腺癌中形成的肿瘤多药耐药(MDR)对治疗肿瘤形成了巨大的障碍。肿瘤多药耐药由多方面的原因造成,例如:药物外排,进入细胞的药物减少和表观遗传修饰。微小RNA(miRNA)是表观遗传修饰的一种,在肿瘤的发生、发展过程中扮演了非常重要的角色。本课题发现并研究了介导乳腺癌化疗耐药的miRNA及其机制。比较乳腺癌化疗耐药细胞系(MCF-7/ADM)及其亲本对照(MCF-7/WT)的小RNA高通量测序结果,得到一批在耐药细胞中表达显著变化的miRNA。以这些miRNA作为出发点,我们主要得出如下结论:1、对高通量测序方法得到的MCF-7/WT和MCF-7/ADM两株细胞的miRNA表达谱进行分析,结果显示miR-149和miR-320a是MCF-7/ADM细胞中显著下调的mi RNA;进一步通过荧光定量PCR方法确认了miR-149和miR-320a在这两株细胞中的相对表达量。结果显示,miR-149和miR-320a在MCF-7/ADM细胞中的表达与MCF-7/WT细胞相比显著下降。用MTT的方法检测mi R-149和miR-320a对MCF-7/ADM细胞药物敏感性的影响。结果显示,在MCF-7/ADM细胞中转染miR-149和miR-320a的模拟物能增加MCF-7/ADM细胞对药物的敏感性。2、深入分析miR-149和miR-320a表达紊乱机制。用启动子活性检测实验发现,miR-149与GPC1共用一个启动子;mi R-320a受独立的启动子调控。甲基化位点检测与亚硫酸盐测序实验发现miR-149和miR-320a在MCF-7/ADM细胞中较MCF-7/WT细胞高度甲基化,从而降低了miR-149和miR-320a的表达。甲基化抑制剂抑制miR-149和miR-320a的甲基化可以提高miR-149和miR-320a的表达。3、对miR-149和mi R-320a的作用机制进行研究。用TargetScan软件对miR-149和miR-320a的靶点进行预测,并在HEK293T细胞中用双荧光报告基因方法验证了NDST1是miR-149的作用靶点之一;miR-320a被证实同时靶向TRPC5及NFATc3。NDST1信号通路激活,介导MCF-7/ADM细胞中的化疗耐药。以miR-320a mimic抑制该mi RNA的低表达,可以通过降低TRPC5及NFATc3的表达,从而显著降低MCF-7/ADM的耐药性。4、在临床乳腺癌穿刺样本中,miR-149和miR-320a亦被发现在化疗耐药的患者中较低地表达,并显著相关于NDST1、TRPC5及NFATc3的高表达。NDST1的高表达乳腺癌患者,其预后较低表达患者显著较差。低表达miR-320a的雌激素受体阳性乳腺癌患者同时也表现出较差的预后。总之,该论文主要发现了miR-149和miR-320a介导乳腺癌化疗耐药的机制,为化疗耐药逆转药物的开发,及临床化疗耐药标志物的建立,提供了理论及实验基础。