新城疫(Newcastle disease)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种严重危害养禽业的病毒性传染病,临床症状以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜及浆膜出血等为特征,死亡率高,传染性强。该病自1926年发现以来,已经在全球范围内暴发4次大流行,给养禽业带来了巨大的经济损失。由于NDV存在基因型多、变异快及免疫易失败等原因,使得传统疫苗保护力不足,不能有效地控制NDV的感染,因此迫切需要探索新的防治策略。microRNA(miRNA)及基因转录在病毒感染宿主的过程中发挥着重要的调控作用,研究NDV感染后miRNAs和mRNAs表达谱,有利于阐明NDV感染与宿主之间的相互作用,为寻找新的防控靶点和方法提供新的思路和策略。本课题主要研究内容和结果如下:1.鸡胚感染NDV后内脏组织miRNAs表达谱测序及分析通过small RNA测序技术获得NDV强毒株(F48E9)和弱毒株(La Sota)感染的鸡胚内脏组织miRNAs表达谱。对差异表达的miRNAs进行筛选,发现F48E9感染引起了33个miRNAs上调,31个miRNAs下调;La Sota感染引起36个miRNAs上调,25个miRNAs下调;La Sota与F48E9感染组间比较,有27个miRNAs上调,22个miRNAs下调。选取10个差异miRNAs进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证,检测gga-miR-34a-5p、gga-miR-375、gga-miR-122-3p、gga-miR-187-3p、gga-miR-124a-3p、gga-miR-203a、gga-miR-205a、gga-miR-183、gga-miR-9-3p和gga-miR-451表达量与小RNA测序结果相似。对差异表达miRNAs进行靶基因预测和生物信息学富集分析,发现在NDV感染鸡胚时,差异表达的miRNAs可参与调控细胞生长代谢、细胞周期及免疫和炎症反应等通路。对抗病毒效果较好的gga-miR-375进行深入研究,发现过表达gga-miR-375可显著地抑制NDV的增殖;RT-qPCR、双荧光素酶报告基因检测及western blot结果均表明gga-miR-375可通过靶向结合NDV M基因,进而抑制病毒的增殖;此外,还发现gga-miR-375过表达后可分泌至细胞上清中,用收集的上清处理NDV感染的细胞,发现外泌的gga-miR-375仍可抑制病毒的增殖。这些结果均表明gga-miR-375对NDV M基因具有转录后调控作用,且可分泌至胞外调控周围细胞的抗病毒作用。2.鸡胚感染NDV后内脏组织转录组测序分析及抗病毒基因筛选为了缩小差异表达miRNAs靶基因的范围,利用RNA-Seq测序技术对NDV感染的鸡胚内脏组织进行mRNAs转录组测序,与鸡基因组比对,对照组、F48E9感染组和La Sota感染组匹配率分别为70.05%、68.55%和71.76%。对差异表达基因(DEGs)进行分析发现,与对照组相比,F48E9和La Sota感染组分别引起了2035和1604个基因表达量的变化,La Sota感染组与F48E9感染组相比,上调360个DEGs,下调668个DEGs。选取10个DEGs进行RT-qPCR验证,检测结果表明ISG12(1)、ISG12(2)、IFI35、Mov10、DHX58、Mx、OASL、TGM2、C8 ORF4及RUNX2表达量与RNA-Seq测序结果一致。对筛选的DEGs进行GO和KEGG富集分析,发现多个位于不同信号通路且能够参与调节病毒复制的关键调控因子,如IFI35、NMI、Mx、OAS*A、STAT1和IFNβ等。对差异表达基因IFI35进一步研究发现,该分子在不同物种中保守性差,但在鸟类保守性较好;在组织表达谱分析中发现,该基因在健康鸡肺脏中表达量最高,其次是脑和法氏囊,且病毒感染后其在组织中的分布与病毒组织分布相似;进一步过表达IFI35后,发现其对NDV增殖有明显的抑制作用,RT-qPCR检测病毒各基因的转录变化发现,NP、P、F及HN基因在过表达IFI35后有明显的降低,Western blot结果表明IFI35与病毒基因共表达时可明显降低V蛋白的表达;此外,RT-qPCR检测IFNs变化时,发现IFI35与IFNα/β/γ表达趋势相似,且IFI35过表达可以促进IFN生成通路上多个基因的表达,进而促进IFNs的产生。这些结果初步证明了IFI35可以通过抑制V蛋白的表达,促进IFNs的产生而发挥其抗病毒作用。3.miRNAs-mRNAs关联分析及抗病毒基因筛选为了获得NDV感染后宿主不同类型基因调节的相关性及普遍性,本研究进一步对NDV强、弱毒株感染鸡胚内脏组织的共同差异表达miRNAs和mRNAs进行关联分析,共获得1069个miRNAs-mRNAs调控关系对。对这些差异表达基因进行生物信息学分析,发现大部分基因能够参与调节物质代谢和生长发育,但也有一部分基因参与免疫反应、炎症反应、细胞凋亡及细胞因子表达等。进一步细化参与宿主免疫或炎症反应通路的基因,共筛选到130个与免疫或炎症相关的miRNA-mRNA pairs,如gga-miR-375-RUNX2、gga-miR-122-3p-MMP13、gga-miR-122-5p-IL17RD等。对抗病毒基因TGM2预测的gga-miR-203a调控关系进行研究,发现RNA-Seq及RT-qPCR结果均表明NDV感染后可以明显地降低gga-miR-203a的表达,促进TGM2的表达;gga-miR-203a过表达时可明显地促进NDV的增殖,而TGM2过表达时可明显地抑制NDV的增殖;RT-qPCR和双荧光素酶报告基因方法进一步验证了gga-miR-203a过表达时可明显抑制TGM2表达,反之,干扰内源性gga-miR-203a时可明显促进TGM2表达,且对结合位点突变后的TGM2表达均无影响,证明了宿主可通过抑制gga-miR-203a促进抗病毒基因TGM2的表达来控制NDV的感染。4.病毒基因转录高通量测序研究基于高通量测序技术,获得不同毒力NDV感染鸡胚组织后病毒NP、P、M、F、HN、L、V及W各基因的转录本,F48E9感染时病毒各基因转录比例为24.94%、22%、10.14%、12.65%、8.27%、3.37%、13.37%和8.21%,La Sota感染时转录比例为26.76%、8.14%、19.43%、9.42%、15.10%、4.16%、5.22%和3.85%;对P/V/W三种基因的转录本进行单独分析,发现F48E9感染时P:V:W的比例为50.48%:30.68%:18.84%,La Sota感染时P:V:W的比例为47.3%:30.33%:22.37%,两种病毒P/V/W转录本差异不显著。对同种病毒感染后不同时间点病毒基因变化做进一步分析发现,F48E9感染雏鸡72 h后,法氏囊中NP、P、M、F、HN、L、V和W基因转录比例为23.89%、15.21%、9.21%、17.93%、13.51%、4.46%、9.95%和11.73%;感染96 h时,各基因的比例为25.58%、16.35%、10.15%、15.86%、12.54%、4.14%、9.84%和5.57%;P:V:W三种基因的转录比例在感染后72 h和96 h分别为48.84%~49.2%:31.92%~32.23%:18.87%~18.94%和48.6%~54.54%:29.24%~30.63%:16.22%~18.77%,差异不显著。为了验证实验结果,本研究利用高通量测序技术,构建了NDV病毒感染后P/V/W转录变化的检测方法,并用该方法检测了F48E9或La Sota感染DF-1细胞后不同时间点,病毒P/V/W转录本的变化,结果发现P、V和W转录比例在病毒感染后比较稳定,与之前结果相似,但不同毒株之间存在差异,且检测到在NDV转录时最多可有10个G碱基的插入。这些结果表明,NDV感染后P基因编辑相对稳定,但在不同毒力毒株之间存在一定的差异;与NDV弱毒株相比,NDV强毒株V基因转录水平相对较高,而W基因转录水平相对较低,提示了V基因转录水平可能与病毒毒力有关。综上所述,本文利用高通量测序技术,一方面,获得了NDV感染鸡胚内脏组织后miRNAs与mRNAs表达谱,分析了F48E9与La Sota感染后宿主应答差异,并对差异表达的miRNAs和mRNAs进行了分析,筛选了抗NDV感染的宿主差异表达基因。深入研究并证实了gga-miR-375可通过调控NDV M基因的表达,达到抗NDV感染的作用;发现抗病毒基因IFI35可通过影响NDV V蛋白的表达促进IFN产生,负调控NDV的感染过程。此外,对NDV感染时miRNAs-mRNAs表达谱进行关联分析,确定了130对与免疫反应相关的miRNA-mRNA调控关系,并证实gga-miR-203a对TGM2的表达具有转录后调控作用,宿主可通过抑制gga-miR-203a来促进抗病毒基因TGM2的表达,进而抑制NDV的复制。另一方面,利用高通量测序技术对NDV P基因编辑频率进行了研究,建立了研究NDV P/V/W编辑的检测方法,并证实了NDV感染后不同时间点P基因的编辑相对稳定,但强毒V基因的转录量高于弱毒,这可能是强毒具有较高拮抗干扰素能力的原因之一。本文通过两方面研究了NDV感染时miRNAs和mRNAs介导的宿主与病毒间的相互作用,为理解NDV致病及宿主抗病毒感染机制奠定了基础。