斑点热是一种由斑点热群立克次体(spotted fever group rickettsiae,SFGR)感染引起、经蜱虫叮咬传播的人畜共患疾病。斑点热内分布广泛,对人类的健康造成严重威胁。该病主要引起发热、皮疹、淋巴结肿大等症状,由于临床特征不能区别于其他发热疾病,常常因误诊而加重病情引发多器官损害甚至死亡。因此建立特异的快速诊断方法应用临床实验室检测尤为重要。实时荧光定量PCR作为一种敏感快速的核酸检测方法,有助于实验室快速诊断立克次体感染,同时可以应用体内感染实验中立克次体拷贝数的定量分析。2013年本课题组在安徽大别山区发热病人体内分离得到一株日本斑点热立克次体近缘株。以此为基础,进一步开展日本斑点热立克次体的致病性研究,而动物模型的建立可以提供一个良好技术平台。本课题开展了两部分的研究,第一部分为建立实时荧光定量PCR检测斑点热立克次体方法,第二部分为构建日本斑点热立克次体感染BALB/c小鼠模型。第一部分研究根据日本斑点热立克次体外膜蛋白A(omp A)基因序列设计特异性引物和探针,建立基于Taq Man探针的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的此检测方法和常规的巢式PCR方法同时对临床收集的80份病人血标本进行检测并比较。结果显示建立的检测SFGR的实时荧光定量PCR方法,标准曲线的循环阈值与模板拷贝数均呈良好的线性关系(r>0.99),且在检测SFGR核酸样本时具有良好的灵敏度、特异性和重复性,与巢式PCR检测临床样本显示两种方法一致率为91.25%,且荧光定量PCR检测的阳性率高于巢式PCR方法。第二部分研究建立斑点热立克次体感染模型。首先将保存的日本斑点热立克次体菌种复苏,感染Vero细胞多次优化培养条件使其能够大量克隆。收集培养物反复多次差速离心纯化获取高浓度的立克次体悬液,使用实时荧光定量PCR进行定量浓度为3.75×106copies/μl。通过腹腔接种途径感染BALB/c小鼠,记录小鼠在第1、3、6、9、15天这5个时间点的体征、体重体温信息以及采集各时间点的血液和脏器样本。通过血细胞计数分析、病理切片观察、荧光定量PCR等技术方法,检测小鼠感染后血细胞变化、HE染色观察脏器病理改变、血液脏器细菌拷贝数以及组织脏器细胞因子表达水平。结果显示与对照组进行比较,小鼠感染后第1天开始耸毛、活动度明显下降,第6天耸毛现象减轻。根据采集的体重数据绘制体重曲线显示小鼠在感染后的第1天体重明显下降,第2天下降至最低水平,随后体重开始回升直到第15天时恢复最开始的水平。血细胞计数中白细胞计数在第3天明显升高,血小板计数在第6天显著升高。对不同时相的小鼠脏器称重显示肝脏和脾脏重量都有明显增加,同时结合小鼠组织HE染色结果,在感染第3天肝脏出现明显的炎症细胞浸润、汇管区可以看到白细胞聚集,第6天、第9天肝脏出现点状、片状坏死,第15天肝细胞坏死有所减轻;肺脏在感染后表现为大量炎症细胞浸润、肺泡壁增厚的症状;结合立克次体拷贝数的测定结果,提示感染后立克次体随血液播散,肝脏在第3天拷贝数达到峰值,肺脏中拷贝数一直维持一个较高水平,对应时间点的肝脏、肺脏都出现明显的病理变化。脏器组织炎症细胞因子IFN-γ、IL-1β、IL-6表达水平的在感染的第3天明显上调,提示立克次体感染早期累计多个器官包括肝、脾、肺、肾,触发机体天然免疫应答,持续细胞因子分泌也可加重器官损伤。VEGF在肺脏中的高表达提示血管通透性的改变,结合立克次体载量上升持续攻击组织细胞,趋化因子CXCL12趋化激活炎性细胞分泌更多的炎性因子导致异常的免疫应答,进一步加剧组织损伤。本研究建立了基于Taq Man探针检测SFGR的实时荧光定量PCR检测方法,为临床实验室快速确诊SFGR疾病提供了快速、有效的技术手段。BALB/c小鼠经腹腔注射途径感染日本斑点热立克次体后,出现的肝脏损伤以及间质性肺炎与日本斑点热病人表现类似,可作为日本斑点热立克次体致病性研究的模型,结合小鼠模型的感染情况对立克次体感染动物的致病性进行初步的探索。