中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）是我国北方重要的海水虾虾类养殖品种,具有极高的经济价值,由于其放苗温度要求高于14℃,限制了它的养殖区域和养殖时间,从而影响了它的上市规格和单位产量。对中国明对虾耐低温品系的培育至关重要,能够扩增养殖区域和养殖大小。本研究通过对中国明对虾仔虾进行低温胁迫处理并进行低温胁迫组与常温对照组的转录组分析,筛选出与耐低温性状相关的基因进行生物信息学分析,并进行原核表达及耐低温验证,以期确定中国明对虾耐低温分子标记,为中国明对虾的耐低温良种培育奠定理论基础。通过对中国明对虾仔虾40日龄野生、40日龄选育、10日龄野生的常温对照组和低温胁迫组共12个样本进行转录组测序,测得576.53 M Raw Reads,过滤后得到521.39 M clean reads,占比90.43%,组装并去冗余后共得到75,905个Unigene。共有 41986 条 Unigene 获得注释,占 All-Unigene 的 55.31%,其中 KEGG数据库注释35.77%、GO数据库注释11.93%。10日龄野生组有14,618个差异基因,其中5,703个上调、8,915个下调;40日龄野生组有13,870个差异基因,其中6,821个上调、7,049个下调;40日龄选育组有22,914个差异基因,其中12,783个上调、10,131个下调。在差异基因的GO注释中,生物过程类注释有20项,富集最多的两类是代谢过程和细胞过程,根据富集气泡图可以看出,细胞过程中mRNA进程和基因表达调控富集最多;细胞组分类注释有14项,富集最多的依次是膜类、膜部分类、细胞类和细胞部分类、细胞器类;分子功能类注释有8项,富集最多的两类则是连接类和催化活性类,根据富集气泡图可以看出,连接类中染色质连接和序列特异性DNA连接富集最多,催化活性类中DNA结合转录因子活性最多。差异基因的KEGG注释主要富集在环境信息处理通路的信号转导通路、代谢及有机系统的免疫系统和内分泌系统相关途径中。以小亚基核糖体蛋白基因为内参基因,对 CL161.Contig1、CL2560.Contig1、CL2861.Contig5、CL5186.Contig2四个基因的real time RT-PCR验证与测序结果相同,表明转录组数据的可靠性。通过转录组数据分析,得到在7个以上比较组中上调的高表达量显著差异基因9个,包括:含bZIP的转录因子、rRNA、RRM域蛋白质、细胞色素b5样蛋白、肌钙蛋白C、胞外蛋白、微管蛋白亚型、lncRNAs。其中,rRNA、细胞色素b5样蛋白及lncRNAs在低温条件下上调表达,在响应低温的相关表达中属于新发现。选择显著上调差异表达基因生物信息学分析为细胞色素b5样蛋白的CL2861.Contig5序列进行了开放阅读框预测和蛋白序列分析,得到一个开放阅读框ORF2861,预测出ORF2861的分子量为16.7kDa,无信号肽、无跨膜区、亚细胞定位可能为内质网,二级结构预测为螺旋有21.33%、β-链有6%、环有72.67%。以大肠杆菌BL21为宿主,利用同源重组方法构建了 pET28a-2861、pET29b-MBP-2861两个重组表达载体,形成表达菌株。16℃ IPTG诱导表达时,pET29b-MBP-2861可溶性表达。通过对是否表达重组蛋白的菌株在0℃和-20℃低温处理12小时及0℃低温处理0-17天的存活率比较,结果表明,重组蛋白的表达明显提高了菌株在低温条件下的存活率。分离纯化后的重组蛋白在体外不能发挥耐低温作用。