白念珠菌(Candida albicans,C.albicans)作为一类条件致病菌,主要寄居在人体的皮肤和粘膜(如口腔、消化道和阴道)表面。在机体免疫功能正常时,白念珠菌与免疫系统维持相对稳态,不会引发感染;而当机体的免疫功能受到抑制时,白念珠菌与机体共存的稳态被打破,白念珠菌迅速繁殖,由共生菌转为致病菌。白念珠菌感染作为最常见的真菌感染,可有不同的临床表现,轻者常引发局部粘膜损伤,重者可穿透组织、侵入外周血液循环,表现为播散性念珠菌病,严重威胁患者生命。近些年来,由于抗生素滥用的现象仍未得到有效解决,且肿瘤放化疗患者以及HIV感染病人的日益增多,导致白念珠菌感染的发病率不断增高,而且播散性感染的病死率居高不下,这些至今仍是难以解决的临床问题。因此,研究白念珠菌的致病机制、特别是深入研究机体免疫系统抗白念珠菌感染的调控过程,可为其相关的感染性疾病的治疗提供帮助。机体抵抗白念珠菌感染的第一道防线是由树突状细胞(dendritic cells,DCs)、中性粒细胞、巨噬细胞等组成的固有免疫应答系统。该系统可以在第一时间通过非特异杀伤的方式清除致病菌,但持续时间不长而且不具备免疫记忆功能。DCs作为专职的抗原递呈细胞(antigen presenting cells,APCs),其表面表达较高水平的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)。这些PRRs的主要生物学功能在于可以识别病原体表面的保守结构,即病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),并由此开启针对病原体感染的免疫应答。白念珠菌细胞壁的PAMPs一旦被DCs表面的PRRs识别,可迅速活化DCs,分泌多种炎症因子和趋化因子,促进对白念珠菌的非特异性免疫清除。DCs的活化机制十分复杂,其核心事件是NF-κB、核转录因子激活蛋白-1(nuclear transcription factor activation protein-1,AP-1)等转录因子的核转位,最终调节多种细胞因子和趋化因子的表达。另一方面,DCs还可以通过PRRs吞噬病原体,并将病原体抗原加工、递呈给T细胞,诱导T细胞分化,指导后续的特异性免疫应答的类型和持续时间。固有免疫是获得性免疫的起点和驱动,而获得性免疫可在固有免疫的基础上发挥更持久且具有记忆功能的免疫效应。值得注意的是,机体抗白念珠菌的免疫应答过程需要多种机制的精细调控,若免疫反应强度过弱,则无法有效清除病原体;但若免疫应答强度过高或持续时间太长,则容易导致机体组织的炎症性损伤。microRNAs(miRNAs)是一类长度约20个碱基左右的单链非编码RNA,可以与靶基因mRNA的3’非编码区(3’UTR)的碱基不完全互补结合,导致mRNA发生降解,或者直接抑制mRNA的蛋白质翻译过程,从而发挥转录后水平的调节作用。miRNAs的作用特点是一个miRNA可以同时在转录后水平对多个基因进行调节,而一个基因的表达强度也可以受到多个miRNAs的调节,miRNAs对靶基因的调节具有明显的时空特异性。近些年来,越来越多的研究表明,miRNAs在免疫细胞的发育和免疫应答的进程中发挥不可忽视的调控作用。在前期的研究中,我们采用microRNA芯片分析了白念珠菌刺激单核源DCs内miRNAs的表达谱变化,结果发现多种miRNAs异常表达,其中miR-155表达显著上调。再者,以往的研究表明miR-155在抗细菌、病毒的免疫反应中具有活跃的调节功能,但目前miR-155在真菌感染免疫中的生物学功能尚不明确。基于以上研究背景,本课题探讨了miR-155在树突状细胞抗白念珠菌感染的固有免疫应答中的调节作用及其作用机制。第一部分热灭活的白念珠菌对树突状细胞及CD4~+Th细胞的活化作用及功能影响目的:研究白念珠菌感染对树突状细胞的成熟及其功能的影响,进而对CD4~+Th细胞的活化和分化的影响。方法:采用磁珠分选的方法从人外周血中分离CD14~+单核细胞和CD4~+Th细胞,加入GM-CSF和IL-4诱导CD14~+单核细胞分化为未成熟的DCs。用热灭活的白念珠菌刺激DCs,检测DCs的成熟表面标志物的表达及炎症因子IL-1β、IL-6、IL-23、TNF-α和IFN-γ的分泌。然后将负载了白念珠菌的DCs与CD4~+Th细胞共培养,通过流式细胞术检测Th细胞的活化及IFN-γ、IL-17等细胞因子的表达变化。结果:热灭活的白念珠菌可以显著上调DCs表面的成熟标志物CD83、CD86的表达,促进细胞因子IL-1β、IL-6、IL-23、TNF-α和IFN-γ的释放。负载白念珠菌的DCs与CD4~+Th细胞共培养后,T细胞表面的活化标志物CD69表达上调,胞内细胞因子IFN-γ、IL-17的分泌水平明显升高。结论:热灭活的白念珠菌可以促进树突状细胞成熟,并诱导CD4~+Th细胞活化分化,发挥有效的抗真菌效应。第二部分热灭活的白念珠菌可以上调树突状细胞内miR-155的表达目的:研究热灭活白念珠菌能否促进miR-155的表达和分泌。方法:用热灭活的白念珠菌刺激DCs,qRT-PCR检测胞内miR-155的表达。收集白念珠菌刺激DCs后的培养上清液,并提取外泌体,检测上清液和外泌体中miR-155的表达。通过qRT-PCR检测白念珠菌刺激DCs后不同时间点炎症因子的变化情况,以及在DCs、单核细胞、THP-1细胞和RAW264.7细胞中miR-155的表达变化。结果:热灭活的白念珠菌可以显著上调DCs内miR-155的表达,并且白念珠菌刺激DCs的培养上清及外泌体中miR-155表达也明显上调。白念珠菌诱导的炎症因子的表达呈先升高后降低的趋势,而miR-155的表达呈持续上升趋势,后期与炎症因子的表达趋势相反。此外,在单核细胞、THP-1和RAW264.7细胞内,白念珠菌同样可以持续上调细胞内miR-155的表达。结论:热灭活的白念珠菌可以持续上调miR-155的表达,且miR-155可以通过外泌体分泌到细胞外基质中。同时白念珠菌刺激下炎症因子的表达呈先升高后降低的趋势,在炎症后期与miR-155的表达趋势相反。第三部分miR-155对DCs分泌炎症因子的调节作用及机制研究目的:探究miR-155对白念珠菌诱导的DCs分泌炎症因子的调节作用以及分子机制。方法:将miR-155的模拟体和抑制体转染DCs,然后加入热灭活的白念珠菌,分别采用qRT-PCR和ELISA检测炎症因子IL-6、IL-23、TNF-α和IFN-γ的变化。采用生物信息学软件TargetScan、miRDB和microRNA.org预测miR-155的靶基因,并通过western blotting和荧光素酶报告基因的方法检测miR-155对靶基因的调节作用,最后转染siRNA干扰靶基因的表达,检测对下游炎症因子分泌的影响。结果:转入miR-155的模拟体后,白念珠菌诱导的炎症因子IL-6、IL-23、TNF-α和IFN-γ的分泌明显降低;而转入miR-155的抑制体后,炎症因子的变化趋势与之相反。在白念珠菌刺激的DCs中,miR-155可以与转录因子NF-κB p65和上游BCL10的3’UTR端靶向结合抑制其表达。此外,干扰BCL10可明显抑制NF-κB信号通路的激活,减弱白念珠菌上调炎症因子的表达能力。结论:在白念珠菌感染中,持续表达上调的miR-155对炎症因子的分泌具有明显的负向调节作用,其作用机制可能与靶向抑制BCL10及NF-κB p65的表达,进一步影响NF-κB通路的激活有关。第四部分白念珠菌活化的DCs内miR-155表达上调的机制研究目的:探究热灭活白念珠菌上调miR-155表达的相关机制。方法:加入Dectin-1的激动剂,采用qRT-PCR检测miR-155的表达变化。在白念珠菌刺激DCs前加入Dectin-1的抑制剂或siRNA预处理,然后检测miR-155的表达变化。分别采用细胞免疫荧光、Western blotting检测热灭活白念珠菌刺激DCs后转录因子NF-κB p65的核转位情况以及MAPK信号通路相关分子的磷酸化表达。在白念珠菌刺激的DCs之前预先加入NF-κB或MAPK信号通路的特异性抑制剂,研究这两条通路对白念珠菌上调miR-155表达的影响。结果:加入Dectin-1的激动剂可以明显上调miR-155的表达,而加入Dectin-1受体的特异性阻断剂或siRNA均会抑制白念珠菌上调miR-155表达的能力。热灭活的白念珠菌可以促进NF-κB p65的磷酸化和核转位,并激活MAPK的ERK、JNK通路及下游转录因子c-Jun的磷酸化;进一步加入NF-κB p65的活化抑制剂可明显抑制miR-155的表达,而ERK、JNK通路的抑制剂可通过抑制c-Jun的活化,降低白念珠菌诱导miR-155表达的能力。结论:DCs表面受体Dectin-1的激活及胞内NF-κB和MAPK信号通路均参与了白念珠菌诱导miR-155表达上调这一过程。