论文部分内容阅读
研究背景利奈唑胺是一种唑烷酮类药物,新创的结构以及与其他已知药物的不同作用机制,使其对临床上愈演愈烈的革兰阳性菌所致感染起到极其显效的作用,并得以推广。特别是诸如耐万古霉素肠球菌(VRE)、多重耐药的葡萄球菌等临床上特殊的革兰阳性菌引起的感染,有很好的抗菌治疗效果。自2007年被批准进入我国以来,在全国各大医院的抗菌方面,发挥着巨大的作用,它使临床上很多耐药细菌需要复合多种抗生素这一问题得到一定的解决。目前已被批准用于治疗多种感染性疾病,在治疗效果上崭露头角,特别是近年来逐渐上升的肠球菌感染,尤其是反复出现的耐万古霉素的肠球菌感染。但是随着利奈唑胺的大量应用于临床,临床分离的肠球菌关于利耐唑胺的耐药现象还是不断出现。目的通过对我院2009年4月至2011年8月近3年来,临床分离的222株肠球菌对其整体以及对其中独立的7株肠球菌进行关于利奈唑胺的耐药监测,了解从我院各科室分离的肠球菌菌株对不同种类抗生素耐药的状况,并且独立明确耐利奈唑胺情况及其相对应菌株关于利奈唑胺的最小抑菌浓度,进一步了解肠球菌对各类抗生素,尤其是针对利奈唑胺的耐药状况。同时对利奈唑胺出现耐药的肠球菌菌株进行基因序列分析,明确其耐药形成的机制,使临床上对抗生素的应用更合理。方法采用细菌鉴定仪(VITEK2Compact)对临床常规分离的222株肠球菌菌株行鉴定且保存。采用琼脂稀释法和E-test纸片法对菌株进行最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)(?)(?)药敏检测,采用基因组提取试剂盒及煮沸法分别提取细菌DNA,对3株耐利奈唑胺的肠球菌提纯的DNA基因进行多重PCR检测,通过琼脂糖的凝胶电泳以及基因测序对扩增的产物来进行鉴定。采用的质控菌株是粪肠球菌ACTT27273、 ATCC29212,得到的数据分别采用SPSS11.0和WHONET5.4软件进行处理分析并统计。结果近3年来从临床分离的标本中共得到菌株222株,粪肠球菌最多,为113株；其次为屎肠球菌,为103株。标本主要来源于痰液(31.5%)、尿液(27.5%)和分泌物(13.5%)。试验的不同种类抗菌药中,3年的总耐药率方面,肠球菌对头孢克罗的耐药率最高(70.7%),接着为高单位庆大霉素(65.8%)、左氧氟沙星(39.6%)和氮苄西林(20.3%),替考拉宁及万古霉素二者的耐药率为最低(均为1.8%)。临床检测结果显示对利奈唑胺出现耐药的肠球菌为3株,且均为粪肠球菌。在耐万古霉素方面,共检出4株耐药株,其中粪肠球菌1株及屎肠球菌3株。耐利奈唑胺方面,用E-test纸片扩散法验证之前琼脂稀释法得到的三株耐药株,另外随机选取4株肠球菌做对比分析,得出7株肠球菌的最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)分别为：琼脂稀释法-菌株244、245、260、363、432、466、505的MIC(μg/mL)分别为8、1、1、2、2、4、6μg/mL。E-test纸片扩散法-菌株244、245、260、363、432、466、505的MIC(μg/mL)分别为12、<0.16、<0.16、0.7、0.5、4、6gg/mL以4μg/mL为耐药中介值得出菌株244、466及505出现耐利奈唑胺现象。将3株耐药菌株提纯DNA后进行基因片段扩增,琼脂糖凝胶电泳处理扩增产物,结果显示获得扩增产物大小为389bp,分别为菌株244、466、505,将三株菌株的PCR扩增产物送上海invitrogen公司测序结果后,软件DNAMAN对序列进行比对后发现：粪标准株的2576位的核苷酸序列显示为鸟嘌呤(G),并呈单峰。其后为菌株244、466及505的23SrRNA-V区域的2579位的核苷酸序列均为鸟嘌呤G。后将三株菌株的DNA序列参照GeneBank中的23srRNA区域的DNA序列进行对比后发现：2576位仍未发现点突变,而菌株466于2711位出现A变为T的现象。经过对菌株466的重复测序发现2711位A突变为T的现象为假阳性。结论通过对临床分离的各株菌株对不同种类抗生素MIC的监测,可知利奈唑胺、替考拉宁及万古霉素三种抗生素仍旧是针对肠球菌较为敏感的抗菌药物。但依然检测出对三种药物的耐药菌株,应引起临床工作者的充分重视。在利奈唑胺方面,肠球菌耐利奈唑胺的现象与报道相一致,已经呈现上升的趋势,在临床病人体液中分离的7株肠球菌的药敏实验中,出现3株体外耐利奈唑胺,比例很大,同时这三例病人之前皆未使用过利奈唑胺抗感染治疗,且其对利奈唑胺的最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)也不小,最大的一株为12ug/ml。说明近年来我院肠球菌耐新药利奈唑胺有严重升高的趋势,可能和肠球菌感染增加及利奈唑胺的广泛运用有关。临床分离的耐利奈唑胺的244,466,505菌株,通过琼脂糖的凝胶电泳和对产物的基因测序显示：三株菌株其2576位没出现基因位点的突变,三株菌株与标准株ATCC27273的2332～2720bp基因序列(23srRNA的V区域)相比较,无变化。这与之前国内外文献所述所有临床肠球菌耐药株中均检测到G2576U点突变存在矛盾,这提示有其他耐药的机制存在。另外,本实验选取的PCR引物为针对23SrRNA-V区域中的第2332-2720bp基因,此范围之外的区域是否存在基因突变仍需验证。但通过GeneBank中的23SrRNA区域的DNA序列对比后发现：菌株466于2711位出现A变为T的现象。但重复测序证实其为假阳性,既便如此,肠球菌耐利奈唑胺是否还存在基因位点的变异机制,目前尚不得知,还须进一步进行探讨。