研究背景和目的糖尿病是一种常见的内分泌代谢疾病,全世界有糖尿病患者1.25亿,世界卫生组织将糖尿病列为三大疑难病之一,其并发症发病率高,导致了高致死率和高致残率。我国是糖尿病患者最多的国家之一,且发病率呈逐年上升趋势。目前,通过口服降糖药物和胰岛素治疗,虽然能有效的控制高血糖,但对慢性并发症的预防和治疗仍缺乏有效措施,同时,连续服用口服降糖药物会出现药物失效、高胰岛素血症和胰岛素抵抗等问题。因此,迫切需要更深入研究糖尿病的发生机理及寻找更有效的药物。中医药防治糖尿病(消渴病)历史悠久,经验丰富。“脾”与“胰”的关系密切,脾虚是糖尿病的重要病机。补中益气汤是益气健脾的代表方,临床上应用补中益气汤加味治疗胃溃疡、糖尿病性胃轻瘫、糖尿病性腹泻等病证,均取得了较好的疗效。本方具有免疫调节作用、抗溃疡作用、体温调节作用、心功能及神经精神调节等多种功能,对胃肠功能的影响十分明确。从多项研究结果来看,补中益气汤的组方有其合理性,同时也说明了其药理作用的复杂性,值得我们深入研究,将其更好的运用于疾病治疗当中。祖国医学在糖尿病的治疗上显示出其独特的优势,故对中医药治疗消渴的研究不容忽视,其中动物实验是不可缺少的重要一环。就目前的研究现状来看,对中医消渴证的研究均采用西医糖尿病模型,即用链脲佐菌素(STZ)或四氧嘧啶等化学方法损伤胰岛细胞造成糖尿病模型,而在中医证型的研究方面,单纯的阴虚、阳虚等证候模型已出现,但将糖尿病特点与中医阴阳两虚证候相结合的动物模型鲜有报道。有学者在2型糖尿病基础上运用中药四气五味的药性来研制阴阳两虚型动物模型,本实验参照其方法研制1型糖尿病阴阳两虚型动物模型。因阴阳两虚证型多见于糖尿病晚期并发症阶段的患者,而金匮肾气丸能滋阴补肾,温阳益气,广泛应用于糖尿病晚期并发症阶段临床表现为肾阴阳俱虚的患者,在临床上有很好的疗效,因此本实验将金匮肾气丸作为反证中药。自1985年木幡阳发现类风湿病人IgG糖链中的Gal低于正常人,据此提出“糖病理学”的学科新分支以来,蛋白质糖链与病理关系的研究逐渐成为生命科学中的研究热点,许多相关的研究成果正不断揭示出过去人们无法解释的许多重要的生命现象。现已发现α-甘露糖苷酶缺陷能导致的细胞病理损害,N-糖基化抑制剂能诱导多种细胞病理损害,N-糖基化与细胞的生存、增殖、分化,及内质网应激相关的病理密切相关。因此,在这一领域开展糖尿病发生机理及中药治疗的研究,具有非常重要的意义。本研究通过分析糖尿病大鼠淀粉酶活性、淀粉酶多种凝集素结合率、甘露糖苷酶活性、胰腺病理、胰腺细胞死亡方式及补中益气丸、金匮肾气丸的作用,初步探讨糖尿病大鼠胰腺损害及补中益气丸、金匮肾气丸作用的糖病理学机制。研究方法和内容1、链脲佐菌素(STZ)制作糖尿病动物模型及补中益气汤的作用造模组动物腹腔注射STZ造模,注射剂量为55mg/kg,8天后再行一次55mg/kgSTZ腹腔注射。造模4周后模型+补中益气丸组大鼠灌服补中益气丸水溶液4周。观察补中益气丸对糖尿病大鼠是否有改善作用。2、中药制作糖尿病大鼠阴阳两虚证候模型及金匮肾气丸和补中益气丸的作用STZ腹腔注射制作糖尿病动物模型后,在此模型基础上用中药复方(青皮、枳壳、干姜、黄柏)水煎液灌胃制作中医阴阳两虚证候模型,用金匮肾气丸进行反证治疗,补中益气丸作为对照药物。观察大鼠症状、体征,用放免法测定皮质醇、游离三碘甲状原氨酸(FT3)、胰岛素、血栓素B2、6-Keto-PGF1α五个指标。3、糖尿病大鼠胰腺病理-淀粉酶活性、淀粉酶凝集素结合率、α-甘露糖苷酶活性的变化及补中益气丸和金匮肾气丸的作用通过病理检测判断胰腺损伤,采用分光光度法测定α-甘露糖苷酶活性及淀粉酶活性,采用凝集素亲和沉淀法(ConA、PSA、PNA、LCA)测定淀粉酶凝集素结合率分析淀粉酶N-聚糖特点,分析正常组、模型组、模型+补中益气丸组、阴阳两虚组、阴阳两虚+金匮肾气丸组、阴阳两虚+补中益气丸组六组大鼠以上指标的变化,初步探讨糖尿病大鼠胰腺损害的糖病理学机制及补中益气丸和金匮肾气丸的作用。4、糖尿病大鼠胰腺病理-胰腺细胞死亡方式及补中益气丸和金匮肾气丸的作用将正常组、模型组、模型+补中益气丸组、阴阳两虚组、阴阳两虚+金匮肾气丸组和阴阳两虚+补中益气丸组六组大鼠的胰腺制备单细胞悬液后,进行DNA抽提,通过胰腺细胞琼脂糖凝胶DNA电泳,检测胰腺细胞是否存在凋亡,初步探讨糖尿病大鼠胰腺损害的细胞学机制及补中益气丸和金匮肾气丸的作用。结果1、采用SD大鼠、中剂量给药和两次给药的方式可提高SD大鼠成模率,降低死亡率。病理结果显示,模型组与正常组相比,症状明显,模型组胰腺腺泡细胞排列松散,胰岛细胞坏死明显;模型+补中益气丸组胰腺腺泡细胞排列松散减轻,胰岛细胞坏死减轻,胰岛细胞有再生现象,症状明显改善。模型组大鼠的肝、胃、肾等脏器均有病理改变及少数大鼠出现肢端坏疽。2、中药复方水煎液灌胃后,大鼠出现体形消瘦,抵抗减弱,形寒肢冷,喜蜷缩,舌暗等症状,金匮肾气丸和补中益气丸治疗后,以上症状均有所改善。阴阳两虚组皮质醇较正常组显著增高(P<0.05),金匮肾气丸和补中益气丸治疗后有下降趋势;阴阳两虚组FT3有下降趋势,金匮肾气丸和补中益气丸治疗后无显著改变。以上指标与临床证候变化趋势相符,也反映出两组大鼠的中医证型为寒证、阴虚证兼夹,符合阴阳两虚证候的特性。阴阳两虚组胰岛素无显著改变,金匮肾气丸和补中益气丸治疗后显著升高(P<0.01)。3、本实验结果显示,①淀粉酶活性:糖尿病模型组较正常组显著降低(P<0.01),补中益气丸治疗后显著增高(P<0.01);糖尿病阴阳两虚组较正常组与模型组显著降低(P<0.01,P<0.05),金匮肾气丸治疗后显著增高(P<0.01),补中益气丸治疗后亦显著增高显著升高(P<0.01)。②淀粉酶凝集素结合率:糖尿病模型组LCA、PNA结合率较正常组显著升高(P<0.05,P<0.01),PSA、ConA结合率有上升趋势;糖尿病阴阳两虚组LCA结合率较正常组显著升高(P<0.01),PNA、PSA、ConA结合率有上升趋势。中药治疗后,三个治疗组的结合率均有不同程度的降低。③α-甘露糖苷酶活性:糖尿病模型组较正常组有下降趋势,补中益气丸治疗后有上升趋势;糖尿病阴阳两虚组较正常组显著下降(P<0.05),金匮肾气丸和补中益气丸治疗后有上升趋势。④胰腺病理切片提示:糖尿病大鼠胰腺腺泡细胞、胰岛细胞都出现了病理改变,治疗组大鼠病变较未治疗组减轻。4、本实验通过胰腺细胞DNA琼脂糖凝胶电泳,发现模型组DNA条带呈“弥散状”,补中益气丸治疗后,“弥散状”的DNA条带显著减弱,阴阳两虚组DNA条带亦呈“弥散状”,金匮肾气丸治疗后,“弥散状”的DNA条带显著减弱,而阴阳两虚组用补中益气丸治疗后,“弥散状”的DNA条带亦显著减弱。未发现明显特征性的DNA梯状条带。结论1、STZ诱导糖尿病模型是一种稳定可靠的方法。选用中剂量给药及两次给药的方式可提高SD鼠成模率,并降低死亡率,维持时间较长,并出现胰腺等多脏器损害及肢端坏疽,利于糖尿病并发症的研究。在动物实验中OGTT比空腹血糖监测更有诊断意义,不易造成漏诊。补中益气丸对糖尿病大鼠的症状与胰腺病理改变有改善作用。2、中药复方(青皮、枳壳、干姜、黄柏)能制作糖尿病大鼠阴阳两虚证动物模型,其机理可能与皮质醇升高、FT3降低有关,金匮肾气丸对阴阳两虚症状及皮质醇升高有治疗作用,进一步说明该方法制作1型糖尿病阴阳两虚证候的动物模型的可行性。补中益气丸对此证型大鼠有一定的治疗作用,推测此动物模型可能存在脾阳虚、脾气虚的情况。3、糖尿病及阴阳两虚糖尿病大鼠的淀粉酶活性和α-甘露糖苷酶活性呈下降趋势,并存在N-糖链缺陷。中药治疗后,指标均有不同程度的改善,提示金匮肾气丸、补中益气丸可改善缺陷的N-糖链。结合胰腺病理改变,糖尿病大鼠胰腺病理损害可能与淀粉酶N-糖链缺陷及α-甘露糖苷酶活性下降相关。金匮肾气丸、补中益气丸可能通过升高α-甘露糖苷酶活性改善缺陷的N-糖链,减轻胰腺病理损害。4、实验结果表明模型组、阴阳两虚组存在明显DNA损伤,补中益气丸和金匮肾气丸均有保护DNA的作用。根据DNA条带形态,推测胰腺损害是由于胰腺细胞坏死而不是凋亡。补中益气丸和金匮肾气丸均可能通过升高α-甘露糖苷酶活性改善N-糖链结构,治疗非凋亡性的胰腺细胞坏死。