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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)库斯塔克亚种(subsp. kurstaki, H3abc)YBT-1520是我室从土壤中分离筛选得到的一株对鳞翅目害虫具有高毒力的专利菌株。菌株YBT-1520全基因组测序结果表明,它含有1条染色体和11个内生质粒,其中染色体的长度为5,401,320个碱基对(bp),质粒的分子量分布在2 kb～416 kb之间。但是该菌株为什么可以含有如此多的质粒,这11个内生质粒有何生物学功能,以及质粒的存在对宿主有何影响还不清楚。本研究采用实时荧光定量PCR的方法测定YBT-1520菌株中11个内生质粒的拷贝数及质粒拷贝数在不同生长时期的变化规律,鉴定质粒的生物量,并对质粒上的基因进行了GO注释和功能分析,为深入了解质粒的生物学行为打下基础。主要工作如下：1.检测以质粒上的不同片段作为定量PCR的靶基因对测定质粒拷贝数的影响。以质粒pBMB67为研究对象,分别以质粒pBMB67上的rep(22308-22447)、orf4(41233-40373)和orf19(62239-62365)为靶基因设计引物,测定pBMB67质粒的拷贝数。结果发现,在质粒pBMB67上3个不同的位点设计引物测得的质粒拷贝数分别为21.3、20.1和21.0,相对标准偏差为3.0%,表明以质粒上的不同片段作为定量PCR检测的靶基因对测定质粒拷贝数没有影响,证明了本研究方法的可行性。2.测定了菌株YBT-1520在对数生长中期(OD600=2.0)时11个内生质粒的拷贝数,结果显示这些质粒的拷贝数分布在1.38～172之间。比较质粒的拷贝数与分子量之间的关系,发现质粒的拷贝数与分子量呈负相关,但也有一些质粒(如pBMB7635和pBMB8240)偏离了这个趋势。这是首次报道用比较灵敏的方法测定同一个宿主中多个内生质粒的拷贝数。质粒的生物量指质粒的拷贝数乘以质粒的长度。本研究发现,在菌株YBT-1520的对数生长中期,11个质粒的生物总量为8746 kb,是染色体生物量(5401 kb)的1.62倍。这个现象是令人非常惊讶的,表明苏云金芽胞杆菌对质粒有着强大的包容能力,让我们对质粒的生物量有了新的认识。3.选取pBMB2062、pBMB67和pBMB293这3个大小和复制方式都不同的内生质粒,监测它们在细菌的不同生长阶段的拷贝数。发现这3个质粒的拷贝数在细菌的整个生长周期都是动态变化的：它们的变化范围分别为71～190、8-23和1-3。值得注意的是,这3个质粒都是在芽胞萌发期(1-2 h)的拷贝数最低；进入对数生长期后,质粒的拷贝数迅速增加,其中pBMB2062在对数生长中期拷贝数达到最大值,而pBMB67和pBMB293在稳定期拷贝数达到最大值；随后,质粒的拷贝数迅速减少,在前芽胞形成后(18 h),质粒拷贝数保持稳定并接近最低值。4.通过计算pBMB2062、pBMB67和pBMB293这3个质粒在对数生长中期和芽胞期拷贝数的比值发现,质粒在两个生长时期拷贝数的比值与质粒的分子量呈负相关。绘制该比值与质粒分子量的关系曲线,并由此推算出其它质粒在芽胞期的拷贝数及生物量,得出质粒在芽胞期的生物总量为5675 kb,这个值接近于染色体的生物量(5401kb)。5. pBMB2062是一个分布广、拷贝数高的小质粒,测定它在菌株YBT-1520、HD-1和HD-136中的拷贝数,发现它在3个不同的宿主中拷贝数分别为172、115和94。证明了质粒在不同的宿主中拷贝数是不一致的。6.对菌株YBT-1520中的11个质粒进行GO注释和功能分析,在注释的399个ORFs中,找到177个与宿主生存相关的蛋白组分,揭示了质粒对宿主生存的重要性。本实验测定了苏云金芽胞杆菌YBT-1520中11个内生质粒的拷贝数,研究了质粒的生物总量,并分析了质粒的功能,这不但有利于更深入的了解质粒的基本特征,同时也为进一步分析质粒的进化、质粒与宿主之间的关系提供了一定的遗传信息和理论基础。