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L-苯丙氨酸是组成蛋白质重要的氨基酸之一,作为人体必需的氨基酸在医药和食品添加剂行业有广泛的用途。近年来更多地用来作合成新型保健甜味剂阿斯巴甜的重要原料使得市场对L-苯丙氨酸的需求猛增。利用固定化细胞制备L-苯丙氨酸具有较强的竞争性,前期研究发现辅酶磷酸吡哆醛的流失是造成固定化细胞酶活下降较快的主要原因,本论文通过构建纤维素硫酸钠-聚二甲基二烯丙基氯化铵(NaCS-PDMDAAC)微胶囊固定化体系,实现细胞和辅酶的共固定化,以获得活性稳定的固定化细胞,为固定化细胞制备L-苯丙氨酸工艺的规模化应用奠定基础。
本论文主要开展了微胶囊原料纤维素硫酸钠制备,微晶纤维素固定化辅酶磷酸吡哆醛研究,以及共固定化细胞酶法制备L-苯丙氨酸的研究。
分别以脱脂棉和木质纤维素为原料,选用非均相反应方法制备NaCS,并对其制备条件进行了优化。确定的优化条件为:选择木质纤维素、浓硫酸:正丙醇为1.4:1(v/v)、反应时间120分钟,反应温度-6℃。并根据确定的反应条件范围,对制备条件进行优化,最终确定利用木质纤维素在固液比为30:1、搅拌转速为150rpm、H2SO4:PrOH为1.35:1、反应温度为-8℃、反应时间为120min时得到产物产率为54%~65%,取代度39%~42.3%,运动黏度为34.5±4-2.3 mPa·s,产品可以满足实验需要,且制备过程中表现出良好的稳定性。
以自制的纤维素硫酸钠制备NaCS-PDMDAAC胶囊。当NaCS浓度在2%以下时胶囊不易成型,基本不能制备胶囊,当NaCS浓度高于6%时,由于溶液黏度太大也不利于胶囊的制备,在NaCS浓度为5%、PDMDAAC浓度为5%时制备得到胶囊膜强较好,满足实验要求。胶囊制备过程中,在其中添加不同类型添加剂,对其成膜强度考察研究发现添加甘油对胶囊膜强几乎没有影响,添加CMC和壳聚糖两种离子聚合物时膜强得到一定的提高,在NaCS溶液中添加氯化钙时,当浓度达到8.5g/L时膜强达到5.01N,相比添加别的物质,以及不添加氯化钙时膜强得到大幅度提高,比较有利于实验及工程应用。微晶纤维素添加量1.6%以下,湿细胞添加量8%以下,对胶囊膜强影响较小。
对微晶纤维素固定化辅酶PLP进行了研究,以微晶纤维素为载体,通过重氮化反应固定磷酸吡哆醛,SESA最佳使用质量分数为15%、亚硝酸钠的滴定量为4ml、反应时间为10小时。所制备的微晶纤维素固定化辅酶对维持固定化细胞活力有效果。
利用NaCS-PDMDAAC胶囊共固定化细胞和固定化辅酶,对共固定化条件进行研究。共固定化细胞制备过程中最佳细胞固定量为5%,固定化辅酶添加量为0.15%。共固定化细胞酶法制备L-苯丙氨酸最佳转化温度为40℃、最佳反应pH为9.2,对其进行批次转化,研究得到共固定化细胞转化半衰期为31d。
通过本论文研究,构建了微胶囊共固定化含酶细胞和固定化辅酶,并成功应用到酶法制备L-苯丙氨酸,取得了明显的效果,延长了固定化细胞的使用寿命,降低了因批次添加PLP而增加的成本,为辅酶和细胞共固定化创立了新的方法,为其工业化生产提供了实验依据。