细丝蛋白A(Filamin A,FLNA)是一种肌动蛋白交联蛋白,与多种结合蛋白相互作用,在细胞迁移、分化、增殖、存活等过程中发挥重要作用。研究表明,FLNA基因突变可以导致人类智力发育迟缓、发育畸形、心力衰竭等疾病。此外,细丝蛋白A还被认定为是一种癌症的标志物。细丝蛋白在细胞质中与信号分子相互作用,通过影响细胞迁移和粘附,可以促进肿瘤的侵袭和转移。但是最新的研究表明:当细丝蛋白定位于细胞核时,可能与转录因子相互作用,抑制肿瘤生长和转移。这些现象凸显了细丝蛋白在调控细胞信号通路中的重要性。因为许多蛋白质的功能都由蛋白质修饰和蛋白质-配体反应调节,阻止蛋白质修饰或扰乱蛋白质-配体反应是药物设计的主要途径。因此,研究细丝蛋白A和配体的相互作用十分重要,这可以为疾病发生的机理提供分子基础,为新药研发提供新靶点。自细丝蛋白A被发现以来,它的结构和功能已被广泛研究。细丝蛋白A由N-端类血影蛋白的肌动蛋白结合域和24个类免疫球蛋白(lg FLN或者R)的重复片段相连,其中,在15、16以及23、24这两组片段之间,分别有合叶状的结构将其分隔开。Hinge-1分离开了序列片段的链1和链2。最终两条长链通过第24重复片段的C末端二聚化使细丝蛋白A形成“V”字型二聚体结构。Rod-1可以与肌动蛋白结合,形成正交形的网状结构。FLNA的Rod-2(R16-23)具有独特的几何结构,重复片段R16-17、R18-19和R21-22成对出现,此区域是细丝蛋白A与配体发生相互作用的主要区域,细丝蛋白A与配体的相互作用主要发生在重复片段的CD面。研究发现Rod-2区域内第18和20重复片段的CD面被第17和19重复片段末端的A链所覆盖,阻止了配体与细丝蛋白的结合,而将A链上的某些氨基酸突变后,这种抑制性相互作用将被解除。天然存在的细丝蛋白A和细丝蛋白B的变异体1缺失41个氨基酸,其中包括第20重复片段的A链,该变异体可以显著增强与整联蛋白的结合。这些现象表明抑制性相互作用是调节细丝蛋白A与配体结合的主要方式。在此基础上,研究者提出了机械力调控FLNA与配体相互作用的机理,即机械力诱导所产生的构象改变可以暴露一个在第21重复片段的整联蛋白的结合位点(R21暴露)。R16-17,18-19和19-21的结构分析表明,它们具有相似的结构,这些结构域对机械力的反应可以通过构象的变化来调节其伙伴间的相互作用,从而将力转化为生化信号。另外,细丝蛋白A的第23重复片段也是一个机械力感受位点,但其作用机制不同于成对的结构域。我们之前已经证明了Fil GAP(Rac1的GTP酶激活蛋白)的两个亚基与细丝蛋白A的两个R23相互作用,并且由于机械力分离FLNA的亚基链从而导致亲和性缺失使Fil GAP解离。研究发现R21重复片段的构象变化并不都发生在富含整合素的粘着斑上,Fil GAP也并不是在所有细胞中都广泛表达,由此说明还存在其它的受机械力调控的细丝蛋白A的结合蛋白。为了研究蛋白质-蛋白质的相互作用,蛋白质亲和纯化和质谱联用技术近年来被广泛应用。其基本原理是将蛋白固定在某种介质上,当细胞抽提液经过该基质时,与蛋白质相互作用的蛋白被吸附到介质上。这些被沉淀的蛋白质随后被质谱检测。但是这种亲和纯化的方法往往会导致非特异性的相互作用。而且随着质谱灵敏度的提高,如何将特异性互作的蛋白从非特异性相互作用的蛋白中鉴定出来具有很大的挑战性。串联亲和色谱在一定程度上可以减少背景蛋白,但是由于其严格的纯化条件,一些弱的相互作用可会丢失。为了解决蛋白质相互作用组学中假阳性的问题,基于稳定同位素标记氨基酸的细胞培养技术(SILAC)的定量蛋白质组学因灵敏度高,精准度好而被广泛使用。SILAC是一种体内标记策略,标记效率高,其基本原理是用含有轻重同位素型必需氨基酸的培养基对细胞进行细胞培养,在细胞生长和分裂的过程中,含有同位素的氨基酸被整合到每一个新合成的肽链中,从而实现细胞内蛋白质稳定标记。因此,从不同细胞群中提取的肽可以通过质谱仪中的质量位移来区分,并通过比较同位素的相对信号强度实现定量分析。另外,氨基酸在蛋白分离纯化之前已经被标记,此方法可以有效的减少实验操作误差。因此,在本实验中,我们将稳定同位素标记氨基酸的细胞培养技术和亲和纯化技术结合,然后进行定量质谱分析。该方法可以有效地区分特异性和非特异性结合蛋白。本课题的第一部分是鉴定与细丝蛋白A第23重复片段相互作用的蛋白。研究发现第24重复片段二聚体化和位于第23,24重复片段间的合叶状结构可以增强第23重复片段对配体的亲和性,因此根据这一特性,我们在原核细胞中表达纯化细丝蛋白A连续的R23-24重复片段,并固定到介质上作为亲和配体。作为阴性对照,我们尝试了两种亲和配体:单独的R24和R23-24(M2474E),该蛋白在R23的Fil GAP-binding位点发生突变,该突变可以阻止Fil GAP与细丝蛋白A的结合。然后小鼠胚胎成纤维细胞分别在含有轻,重同位素标记的赖氨酸和精氨酸的培养基中培养,经过六次细胞传代培养,使同位素标记的蛋白含量大于95%。同时使用赖氨酸和精氨酸标记,可以保证酶解后的每一个肽段都被标记,从而提高定量分析的精准度。在本实验中,我们使用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF),是因为我们发现Fil GAP并不在该细胞中表达,因此在此细胞中可能有类似于Fil GAP的分子可以与FLNA的第23重复片段结合。利用亲和配体,我们从标记有轻氨基酸或重氨基酸的MEF细胞的裂解液中亲和纯化相互作用的蛋白。准确的说,实验组和对照组亲和配体分别从等量的标记重氨基酸,和轻氨基酸的的细胞碎片中分离纯化蛋白复合体。将等量的蛋白复合体混合,由预制胶展开,并用考马斯蓝染色,最后将蛋白胶剪切成数片,并对每一片进行胶内酶切。提取出来的肽段经质谱、数据分析和数据库搜索后,实验组结合的特异性蛋白质的量与对照组相比会发生变化,从而可以识别与实验组特异性结合的蛋白。结合质谱数据与蛋白在细胞内的定位,我们筛选出了以下可能的候选分子:Ankycorbin蛋白(Rai14)、重组人类鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(I)/G(S)/G(T)亚单位乙2(Gnb2)、肌球蛋白磷酸酶Rho相互作用蛋白(Mprip)、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(k)亚单位(Gnai3)、膜突蛋白(MSN)、人板层素相关短肽2亚型alpha(Tmpo)和Polo-like激酶(PLK1)作为新的FLNA的结合蛋白。虽然SILAC技术可以通过定量来区分特异性结合和非特异性结合的蛋白,却不能排除间接相互作用的蛋白,因此我们利用体外融合蛋白沉降技术去验证它们是否有直接的相互作用。我们首先设计引物扩增候选蛋白基因序列,然后分别克隆到真核表达质粒p Ac GFP-C1,瞬时转染真核HEK 293A细胞24-48小时,收取细胞并借助蛋白免疫印迹实验验证。初步结果表明,PLK1可以直接与FLNA的R23相互作用。然而,需要进一步研究以确保这种相互作用发生在活细胞中。本课题的第二部分是为了研究细丝蛋白第21重复片段的结合蛋白。同样根据细丝蛋白A的结构,我们以R21-23为亲和配体,R21上的CD面是众多配体的结合域,而R1-3的CD面与R21的CD面在结构上明显不同,因此我们以R1-3作为阴性对照。在此研究中我们发现了一种新的细丝蛋白A的结合蛋白,平滑肌蛋白(SMTN)。我们发现,虽然平滑肌蛋白不与全长细丝蛋白A相互作用,但它可以与细丝蛋白A变异体1(FLNAvar-1)结合。为了查找平滑肌蛋白与细丝蛋白A的结合位点,我们构建了细丝蛋白A的截短体,通过免疫印迹技术确定了与细丝蛋白A结合的主要区域,并比对已知的细丝蛋白A结合配体的氨基酸序列,利用点突变技术确定了影响相互作用的几个关键氨基酸。接下来利用突变的平滑肌蛋白研究FLNA-SMTN相互作用对活细胞中SMTN的动力学和分布的影响。我们在细胞内表达野生型和没有细丝蛋白A结合位点的GFP-平滑肌蛋白突变体,并运用光脱色荧光恢复技术分析不同机械力下相关的结合动力学。光漂白后的荧光恢复表明,没有细丝蛋白A结合位点的SMTN的扩散速度快于野生型SMTN。为了消除肌球蛋白产生的内力,我们用肌球蛋白抑制剂Y27632(Rho激酶抑制剂,调控肌球蛋白收缩)作用于细胞,实验结果表明Y27632抑制激酶也增加了SMTN的扩散速度。这些数据表明SMTN可以与FLNAvar-1相互作用,并在细胞中机械激活FLNA。平滑肌蛋白主要表达存在于完全分化的平滑肌细胞内,它有两个变异体:平滑肌蛋白A和B,在人体中,平滑肌蛋白基因和高血压、脑梗死及心肌梗死紧密相关。平滑肌蛋白-B的缺失会导致一系列的血管失调疾病(血管平滑肌细胞失去收缩能力)。尽管平滑肌蛋白被视为高度分化的平滑肌细胞的标志,它的表达对于研究血管畸形和损害具有很大的价值,但是其功能尚未被详细的研究,其原因可能是难以获得用于生化分析的可溶性材料。在本实验中我们已经成功地获得了大量纯化的平滑肌蛋白,并发现平滑肌蛋白只结合于F-肌动蛋白网络,但是不交联肌动蛋白。我们发现通过机械力诱发细丝蛋白A-平滑肌蛋白的相互作用可以增强细丝蛋白A-肌动蛋白网络的机械学性质。接下来我们需要更深入的探讨细丝蛋白A和平滑肌蛋白的相互作用是如何影响正常的骨架机械学和血管平滑肌细胞的收缩。通过深入研究丝蛋白与平滑肌蛋白的相互作用分子机制,有望为心血管疾病提供更为有效的治疗方案。综上所述,本文主要研究了细丝蛋白A的机械学结合配体。我们建立了基于SILAC结合亲和纯化实验的定量相互作用组学技术,并用计算机协助筛选出细丝蛋白A的结合位点。本研究初步验证了PLK1可以与FLNA结合,并深入研究了平滑肌蛋白与FLNA的相互作用。相信随着细丝蛋白更多机械学配体的发现及研究,可为新药研发提供新靶点,实现基础研究向临床研究的转化。