质粒是一种共价闭合环状双链DNA,广泛存在于微生物中,是不同于基因组且独立于基因组之外的DNA。可以自主复制,其大小由几kb到几百kb不等。质粒在基因工程中的用途广泛,有着重要的作用。实验室常用的质粒通常包含复制子,抗性基因,多克隆酶切位点等原件。复制子决定了质粒在宿主菌中的拷贝数,抗性基因是一种筛选标记,多克隆位点上含有多种核酸酶酶切位点,可以方便外源基因片段的插入,从而有利于外源基因的克隆及表达。但是,质粒对宿主菌的蛋白表达谱会产生何种影响,目前还不是很清楚。因此本实验就实验室中保存的常用质粒为研究对象,以大肠杆菌为宿主细菌,探讨哪些质粒载体会对宿主菌产生哪些具有重要意义的影响。由于大肠杆菌具有清楚的遗传背景,生长周期短,生长速度快,安全性好,操作简单等优点,是工业生产和科研的常用宿主菌。随着蛋白组学的发展,测定大肠杆菌表达的全部蛋白质成为了可能。因此本实验拟利用蛋白质组学技术,研究实验室常见的质粒载体对大肠杆菌全菌蛋白表达谱变化的影响。本实验所选用的质粒有自杀性质粒pXL275,克隆载体pACYC184、pEASY-T3、pUC19、pAK,表达载体pPROEX HTB,结合辅助质粒pRK2013等,所选用的宿主菌是MG1655,后者是经典的大肠杆菌K-12系列菌株。自杀性质粒、克隆质粒、表达质粒通过电转入大肠杆菌MG1655,而结合辅助质粒pRK2013较大,不能通过普通的质粒提取和电转方式导入大肠杆菌,故借助诱动转移的手段导入MG1655,目的菌株均通过相应抗性筛选获得。导入外界质粒的大肠杆菌通过双向电泳检测发现:pXL275、pUC19、pAK、 pPROEX HTB、pRK2013、pACYC184均不会引起大肠杆菌全菌蛋白谱的显著变化,而质粒pEASY-T3则引起大肠杆菌表达谱明显的变化。我们对具有显著差异的蛋白点进行了生物质谱分析,共鉴定到了33个蛋白点。其中pEASY-T3对大肠杆菌的蛋白表达产生的影响有(1)蛋白表达量缺失：磷酸戊糖变位酶,基因名为deoB;谷氨酸脱羧酶A,基因名为gadA;苹果酸合酶A,基因名为aceB;γ-氨基丁醛脱氢酶,基因名为prr;二肽转运子,基因名为dppA;超渗透诱导周质蛋白,基因名为osmY;通用应激蛋白,基因名为uspG;压力响应蛋白,基因名为hdeA;酸抗性蛋白,基因名为hdeB;保守蛋白YgiW,基因名为ygiW。(2)蛋白表达量明显下调：异柠檬酸裂解酶,基因名为aceA;甘油激酶,基因名为glpK-,塔格糖-1,6-二磷酸醛缩酶,基因名为gatZ;二氢硫辛酰转琥珀酰酶,基因名为sucB;乙醛脱氢酶B,基因名为aldB;烯酰基-酰基载体蛋白还原酶,基因名为fabI;乙二醛酶,基因名为hchA;铁结合和贮藏蛋白,基因名为dps。(3)蛋白表达量明显上调：p-半乳糖苷酶,基因名为lacZ (载体质粒基因编码)、p-内酰胺酶,基因名为ampC (质粒载体编码)。根据pUC19和pEASY-T3质粒图谱的不同,我们克隆了f1片段,并与pUC19重组,构建重组载体pUC19-fl,电转至大肠杆菌构建菌MG1655/pUC19-fl。 MG1655/pUC19-fl双向电泳和MG1655/pUC19经IPTG诱导后双向电泳显示两菌GadA的表达下调,提示LacZ和n片段对GadA的表达有影响,然而具体机制还需要探索。总结：质谱鉴定结果表明,质粒pEASY-T3抑制了MG1655的10种基因的表达,造成了蛋白的缺失表达。8种蛋白表达量明显下调,2种蛋白表达量明显上调。在pEASY-T3直接抑制的10种基因中,与酸抗性相关基因gadA是目前研究的热点。可能对大肠杆菌抵御酸性环境产生影响,影响大肠杆菌在酸性环境下的生存能力。同时也说明质粒pEASY-T3对宿主菌蛋白的表达干扰很大,可能不适合作为载体用来评价外源基因的功能。