木聚糖酶在木聚糖类化合物的转化中具有重要的应用,但目前发现的木聚糖酶以中性酶居多,很难适应造纸、饲料等行业高pH的反应条件。利用蛋白质工程手段对木聚糖酶进行改造和修饰被认为是获得碱性酶源的有效方式,而其前提是要了解碱性木聚糖酶的耐碱机制,近年来这方面的研究受到广泛关注。在此背景下,本文以实验室前期研究的来源于嗜碱细菌Cellulomonas bogoriensis的碱性木聚糖酶Xyn466为研究对象,对其进行了基因克隆和异源表达,并利用定点突变技术改变了重组酶某些氨基酸的性质和组成,从催化残基附近氨基酸的影响及氨基酸组成两方面研究了碱性木聚糖酶的耐碱机制,研究内容及结果如下:1.对重组酶Xyn466进行了基因克隆,并在大肠杆菌中实现了异源表达,纯酶组分的比酶活为261.50 U/mg。酶的最适pH值为8.0,在pH 10.0时仍能保持最高酶活力的40%以上;同时Xyn466具有较好的pH稳定性,在pH 4.0-11.0范围内保温24 h,剩余酶活力均能保持在70%以上,是用于研究碱性木聚糖酶的良好酶源。2.对Xyn466催化残基Glu166周围的三个氨基酸（A167,F168和A169）进行疏水性和电荷性质的突变,测定突变体酶的活性及pH特性,研究了催化残基附近氨基酸性质对木聚糖酶耐碱性的影响,得出如下结论:（1）167位和168位氨基酸疏水性的变化降低了Xyn466的活性,同时对酶的pH特性产生显著影响。氨基酸疏水性增强使酶在酸性条件下的活力降低,碱性条件下的活力升高,并提高了酶的pH稳定性。（2）169位氨基酸突变体酶的比酶活和Xyn466相差不大,氨基酸疏水性的变化对酶的pH特性影响并不显著,但氨基酸的电荷性质对酶的影响较大,消除氨基酸所带的负电荷可使酶的最适pH向酸性偏移,pH稳定性也有所下降;引入正电荷能提高木聚糖酶的最适pH,降低酶在酸性条件下的活力而提高其在碱性条件下的活性。3.通过向木聚糖酶Xyn466中引入中性亲水氨基酸残基或精氨酸残基而改变重组酶的氨基酸组成,测定突变体酶的活性及pH特性,以研究中性亲水氨基酸及精氨酸对木聚糖酶耐碱性的影响,得出如下结论:（1）中性亲水氨基酸含量的变化对Xyn466的比酶活并未产生明显影响,但却影响了木聚糖酶的pH特性。当中性亲水氨基酸含量增多时,降低了酶在酸性条件下的活性,而升高了碱性条件下酶活性,尤其是极碱条件下的活性有所提高,同时这一方向的突变提高了木聚糖酶的碱稳定性。相反中性亲水氨基酸的减少会使木聚糖酶的耐碱性减弱,脱酰胺使酶的最适pH向酸性偏移,也降低了碱性条件下酶的活性。（2）精氨酸含量的变化对Xyn466酶活的影响较小,但对木聚糖酶pH特性的影响较显著。精氨酸含量的增加虽然使酶的最适pH向酸性发生偏移,但却大大提高了酶在极碱（pH 11.0-12.0）条件下的活力和稳定性。同时多点突变的结果显示出精氨酸增加的越多,重组酶pH变化越显著。（3）基于序列比对结果,将Xyn466中赖氨酸突变为精氨酸以增加酶分子中Arg/Lys的比值,结果显示突变体酶的最适pH并未发生明显变化,但酶在碱性条件下的活性有所增高,而酸性条件下的活性相应降低;同时,这些突变也提高了木聚糖酶的稳定性,使酶在碱性条件下（尤其是pH 12.0）的稳定性显著提高。本文的研究为碱性木聚糖酶耐碱机制的阐明提供了信息,也为适合于工业生产的碱性木聚糖酶的获得提供了酶源和可能的改造方向。