生物芯片技术发源自20世纪90年代初,它利用先进的微型化技术,将数以万计的生物样品与复杂的功能结构集成在一块几平方厘米的芯片上,实现高集中,高通量,高精度的快速检测与分析。利用DNA芯片的生产技术,将数百到数千种蛋白点制在芯片上面,然后分析生物样品中的蛋白质,被结合的蛋白质可以通过后续的手段进行分析,如荧光成像、时间飞行质谱分析、肽质量指纹分析等。这种新型的蛋白质分析方法可以取代传统的蛋白印迹法和酶联免疫吸附法,可以快速的、高通量的研究疾病相关蛋白或蛋白质之间的相互作用。虽然这种蛋白质芯片技术与基因芯片技术相似,有显著的优越性,尤其是只需要微量的珍贵的蛋白质样品,被检测的生物样品的用量也很少,但现实中,这种技术的应用受到很多的限制。制作蛋白质芯片远远要比制作基因芯片来的复杂和困难。与已经成熟的DNA芯片相比,蛋白质芯片有着自己的特殊性：1、蛋白质的化学性质及空间结构均十分复杂,受环境影响容易变性；2、蛋白质来源有限,不能大量人工合成；3、蛋白芯片的基础是抗原抗体亲和反应,特异性及亲和力有限,尤其当固定在表面时。4、不同的蛋白质在临床样品中的丰度不同,抗体抗原反应的亲和力不同；5、蛋白质之间存在着交叉反应。在临床诊断中,基于酶联免疫吸附分析原理的低密度的蛋白质芯片最具有应用的价值,已经逐渐应用于临床检测。酶联免疫吸附分析(ELISA)是蛋白质定量实验的经典方法,一般是在96孔板上进行,具有较高的稳定性与灵敏度。在此基础上结合自动化机械臂,及微点技术,这就形成了最初的蛋白质微阵列芯片。要发展一种可靠而高效的蛋白质芯片,必须有一个较大量结合蛋白,同时较小影响蛋白活性的固定表面。区别于研究用的蛋白质芯片,临床应用的诊断性芯片必须具备成本低、容易生产、容易反应、稳定性好、均一性强等特点。寻找适合蛋白质固定的基底材料,以及高效固定蛋白的方法成为该领域迫切的需求。对于一种能有效进行分析的蛋白质芯片的制作来说其中一个最大的挑战来自于选择合适的固相载体以及表面化学修饰的方法,这种表面能够与不同性质的蛋白质结合,能保持蛋白质的完整性、天然结构以及生物学活性。一个理想的蛋白质芯片表面必须具有以下几种优点：1、能稳定的结合足量的蛋白或探针；2、保持蛋白或多肽在表面的活性；3、表面构型有利于表面蛋白或探针结合待测液中的靶标；4、背景信号要低。PDMS,聚二甲基硅氧烷Poly(dimethylsiloxane)在生物医学上被广泛应用,这种高分子材料具有化学惰性、无毒性、容易操作、原材料多、廉价等优点。如果能对PDMS进行表面修饰用于生物芯片的固相材料,将会是一种有效、省时的可行方法。但是由于PDMS表面的化学惰性,急需要一种容易的方法能对PDMS进行表面修饰。对PDMS的表面修饰方法尝试了很多,通常分为物理吸附和化学偶联两大类。化学偶联方法进行的修饰比较稳定,但是在化学惰性的PDMS表面很难做到。马宏伟等发明了一种能够对PDMS表面进行永久性和功能性修饰的方法。这种方法是在P DM S制作过程中掺入一种引发剂,称为i P D M S。然后采用表面引发原子力聚合方法(SI-ATRP)在i P D M S表面进行P E G修饰,植入O E G M A层。这层修饰层具有很好的抗蛋白非特异性吸附的性能,而且可以根据需要调节修饰层的厚度和密度,从而调节表面的亲疏水性。这种经过修饰的表面可以用于生物传感器、微流体芯片、细胞芯片、蛋白质平面芯片等对表面化学要求很高的领域。在本研究中,我们试图在这一种新型的材料上面进行蛋白质芯片检测体系的建立,检测的原理基于双抗体夹心法,可以同时检测超过10个指标,指标为肿瘤标志物。整个研究包括固相载体制备和表面化学、一抗的固定,多种标准品混合液的制备、多种标记抗体混合液的制备、检测流程的建立,最终获得一种基于双抗体夹心法的能并行检测多种指标的蛋白质芯片分析系统,该系统能够符合临床检测的需求。第一部分iPDMS的制作和表面功能化修饰这一部分研究的主要目的是制作厚度、硬度适中,表面修饰适合抗体微阵列点样的iPDMS片基。将sylgard184中的粘性基团(A)和硬化剂(B)以及引发剂v-引发剂(C)按10：1：0.1(A：B：C)的比例混合,倒入6.6×7.7 cm2的模具在80℃硬化2个小时。形成一张半透明的弹性胶状膜iPDMS。继续采用表面引发聚合技术,将iPDMS浸入引发液中在氩气的保护下～25℃引发2个小时。引发液的成分为OEGMA526/CuC12/Bipy/AscA=20/1/2/1,其中CuCl2的浓度是2.76 mM。已经在表面形成多聚OEGMA的iPDMS片基继续在1M的溴乙酸和2M的氢氧化钠溶液中浸泡过夜,在表面生成羧基。经过去离子水充分淋洗后用液氮吹干。最后得到的iPDMS膜用XPS扫描,其表面原子的组成符合计算值,韧性为Young’s系数E∽2.12 MPa,表面接触角θ∽°±0.4°,用椭圆偏振法测定其表面的OEGMA修饰层的厚度大约为311.4±4.8A。第二部分蛋白质芯片联合检测系统的建立蛋白质芯片检测系统包括点有蛋白质微阵列的芯片、多种抗原的混合标准品、多种酶标二抗的混合液、化学发光底物以及其他的试剂。同时也包括检测流程、信号阅读仪器和数据处理软件。首先是将表面已经经过修饰的iPDMS用0.1 M EDC和0.1 M NHS混合液活化30分钟。然后用HD-2003A点样仪将12种肿瘤标志物的一抗点至iPDMS上,并且用NC作为对照。点样环境为温度24℃和湿度45%。点样的抗体的排列、抗体的稀释度和稀释液根据实验需要调节。12种混合标准品采用冻干的方法,浓度用各种参比方法测定。其他的试剂根据实验结果进行调配。检测仪使用制冷的CCD摄像头,数据处理软件为Bioca 5.0。在这一部分研究工作中,我们制备了一种能检测12种肿瘤标志物的蛋白质芯片系统,12种肿瘤标志物包括CA19-9, CA242, AFP, NSE, CEA, CA125, CA15-3, CA72-4,c-PSA,β-HCG,SCC和CK19。每个指标的浓度和信号之间呈现了良好的线性关系。各指标的配对抗体和其他不相关抗原之间未发现交叉反应。而且由于iPDMS的弹性性质和抗非特异性蛋白吸附的性能,使得芯片的装配和反应比NC简单,生产过程中不需要封闭环节,在用ELISA法检测抗原的过程中清洗的步骤变得尤为简单。第三部分：蛋白质芯片制作和ELISA反应的参数优化影响蛋白质芯片质量的因素很多,主要包括固相载体和表面化学、点样稀释液、反应流程等。我们需要对这些环节的参数进行调整,以达到最佳的应用效果。首先是iPDMS表面的亲水性,我们发现当接触角处在42°-48°范围内时,比较适合IgG的结合,过高的亲水性会造成环形点,过高的疏水性使蛋白无法结合。抗体的点样浓度控制在饱和结合量以下,过高的抗体浓度超过了iPDMS表面的承载能力,会引起蛋白溢出,形成拖尾。通常iPDMS表面抗体的结合饱和浓度在0.2mg/ml左右,每种指标的一抗也进行了饱和点样浓度的确定。在抗体的稀释液中适当添加1%的甘油、0.1%的tritonX-100、3%的甘露醇可以有效地改善点形、提高点的信号,延长蛋白质的稳定性。在点样结束后,将蛋白质芯片放置于氮气,合适的温度和湿度,以及延长放置时间,都有助于蛋白质在iPDMS表面的充分结合,保持抗体免疫学活性。在检测流程中,我们在化学发光底物中也添加了表面活性剂,改善了化学发光底物在iPDMS表面的流动,消除了由于化学发光底物流动造成的芯片图像雾状现象。第四部分以iPDMS为基底的蛋白质芯片的检测性能研究作为诊断试剂,最重要的还是产品的质量。对于蛋白质芯片定量系统来说,首先必须符合临床检测的要求。性能的评估内容包括化学敏感度、线性范围、精密度、准确性、稳定性等。由于iPDMS的抗非特异性吸附的能力,基底的背景接近于零,使得LOD明显降低,敏感度增强,有些指标的LOD甚至达到了20pg/ml,对于临床应用的大部分指标来说,这一敏感度已经完全足够了。一次检测并行孔和多次检测之间的CV值均小于15%,符合免疫学检测的精密度要求。稳定性试验显示蛋白质芯片系统在4℃至少可以存放半年以上,37℃存放1周,蛋白质芯片的信号没有下降,表示该芯片能够保证在运输过程中不会出现失活。我们检测了一些临床上已知浓度的肿瘤血清,同时用NC芯片和iPDMS芯片检测,虽然检测的结果在数值上有所差异,但是临床上的阳性指标在芯片上也表现出阳性。关于准确度的对照,有待开展更加详细和大规模的研究。