论文部分内容阅读
肿瘤血管生成与多种肿瘤的生长、转移、复发和预后密切相关,肿瘤血管生成是一个多因素参与,多步骤复杂的过程,包括黏附、基质降解与移动,抑制其中任何一个过程理论上均可抑制肿瘤的侵袭转移。因此,以肿瘤血管生成为靶点,开发血管生成抑制剂在抗肿瘤研究中是一个新的十分活跃的研究领域。其中,中医中药具有取材简便,毒副作用少的特点,将众多研究者的目光吸引到天然药物的研究上来。以天然药物为研究对象,来探讨和研究新型的抗肿瘤药物已逐渐成为当今热点。本试验旨在研究并证明传统中药半枝莲黄酮类化合物的抗肿瘤活性,继之课题组的前期研究结果:半枝莲活性成分抑制胃癌细胞VEGF表达,从肿瘤细胞增殖、凋亡、以及Survivin以及PTEN角度探讨半枝莲黄酮类化合物的抗肿瘤作用机制,为进一步开发高效低毒的抗肿瘤药物奠定理论基础。我们采用系统溶剂分离法、硅胶柱层析法等方法,获得半枝莲不同极性的提取物,以MTT比色试验及流式细胞术等技术为手段,从中筛选出抑制肿瘤细胞增殖作用较强的成分。采用免疫细胞化学、Western blot等方法,进一步研究其抑制肿瘤生长、侵袭和转移的作用及其机理。实验结果如下:1、半枝莲黄酮化合物的提取与分离:硅胶柱层析法以氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱(10:0;100:1;100:2; 100:4;100:8;100:20;100:50;0:1),收集洗脱液,由硅胶薄层(TLC)检识,相同流份合并,共得8个部位(A、B、C、D、E、F、G、H),半枝莲抑制肿瘤细胞增殖有效成分的筛选:经MTT法检测活性,选择活性强的部位D。半枝莲黄酮化合物D不同浓度(10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、160μg/ml)与空白对照组比较能有效抑制SGC-7901细胞系以及BGC-823细胞系的增殖,且呈较明显的浓度依赖性。2、半枝莲黄酮化合物诱导肿瘤细胞的凋亡:随着药物浓度的增加,细胞凋亡率逐渐增加。30μg/ml、60μg/ml、120μg/ml半枝莲黄酮化合物作用SGC-7901细胞、BGC-823细胞24h后凋亡率与阴性对照组比较差异均有统计学意义(p<0.01)3、半枝莲黄酮化合物抑制SGC-7901细胞和BGC-823细胞Survivin蛋白的表达:免疫细胞化学法可见,随着药物浓度的增大及作用时间的延长,棕染逐渐变浅,表明Survivin蛋白表达逐渐减少。60μg/ml、120μg/ml半枝莲黄酮化合物作用SGC-7901细胞、BGC-823细胞24 h后Survivin表达与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);30μg/ml、60μg/ml、120μg/ml半枝莲黄酮化合物作用SGC-7901细胞、BGC-823细胞48 h后Survivin的表达与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);60μg/ml半枝莲黄酮化合物作用于细胞SGC-7901细胞48h后的Survivin表达与同浓度作用24h差异有统计学意义(P<0.05)。60μg/ml、120μg/ml半枝莲黄酮化合物作用于BGC-823细胞48h后的Survivin表达与同浓度作用24h比较差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot可见,随着药物浓度的增大及作用时间的延长,Survivin的表达条带颜色逐渐变浅,实验结果与免疫细胞化学基本一致。40μg/ml、80μg/ml半枝莲黄酮化合物作用SGC-7901细胞24 h后Survivin表达与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);160μg/ml半枝莲黄酮化合物作用SGC-7901细胞24 h后Survivin表达与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01); 80μg/ml、160μg/ml半枝莲黄酮化合物作用SGC-7901细胞48 h后Survivin表达与同时段空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01); 160μg/ml半枝莲黄酮化合物作用SGC-7901细胞48h后Survivin表达与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);4、半枝莲黄酮化合物促进SGC-7901细胞和BGC-823细胞PTEN蛋白的表达:免疫细胞化学法可见,随着药物浓度的增大及作用时间的延长,棕染逐渐变浅,表明Survivin蛋白表达逐渐减少。120μg/ml半枝莲黄酮化合物作用SGC-7901细胞PTEN的表达与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05); 120μg/ml半枝莲黄酮化合物作用于细胞48h后的Survivin表达与同浓度作用24h差异有统计学意义(P<0.05)。60μg/ml半枝莲黄酮化合物作用BGC-823细胞24 h后PTEN表达与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);120μg/ml半枝莲黄酮化合物作用BGC-823细胞24 h后PTEN表达与空白对照组比较有差异有统计学意义(P<0.01);60μg/ml、120μg/ml半枝莲黄酮化合物作用BGC-823细胞48h后PTEN的表达与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);120μg/ml半枝莲黄酮化合物作用于细胞48h后的PTEN表达与同浓度作用24h比较差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot可见,随着药物浓度的增大及作用时间的延长,PTEN的表达条带颜色逐渐变深,实验结果与免疫细胞化学基本一致。结论:半枝莲黄酮化合物在体外具有抑制肿瘤细胞Survivin蛋白表达、促进PTEN蛋白表达的作用,其作用机理可能是通过下调Survivin,上调PTEN,抑制Survivin对VEGF的正调控,增强PTEN对VEGF的负调控,借以达到下调VEGF的表达,抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡,从而实现抑制肿瘤细胞迁移和阻断肿瘤血管生成。