前言结直肠癌是全球导致死亡最多的癌症之一。鉴于其发生和发展缺乏明显的生理改变,临床症状也无特征性,以致多数患者往往在病情中晚期才到医院就诊,错过了最佳治疗时机。因此,发现对早期结直肠癌诊断的新型生物分子标志物对患者预后至关重要。不仅如此,这样的分子标志物理应能够准确地鉴别组织中是否有癌细胞的浸润,给出癌或非癌的确切诊断。microRNA就是这一种具有诊断、预后、甚至治疗价值的潜在肿瘤生物分子标志物。我组已于前期研究[3]筛选出一批并与结直肠癌的早期诊断及相的关microRNA。本研究旨在进一步于组织学水平验证这种表达差异,并与常见的结直肠癌免疫组织化学指标相对照,以便更充分地了解microRNA在病变演进过程中的变化,并揭示其在病变中的功能。本研究就挑选了前期研究中筛选出的其中一个具有代表性的结直肠癌癌变相关的microRNA分子——miR-92a,并利用原位杂交技术显示miR-92a在组织中的表达差异及相关标志物免疫组织化学结果的相互关系。MicroRNA原位杂交方法的建立及优化有别于传统的原位杂交,microRNA原位杂交方法是针对以下决定性因素建立并优化的技术：1)目的microRNA的含量；2)杂交的温度；3)探针浓度以及4)严洗温度,同时为避免microRNA在杂交过中受外界因素降解,实验过程中各用品应按照RNA级处理及配备。透过比较不同实验步骤,对原有《miRCURY LNATM microRNA ISH Optimization Kit (FFPE) Instruction manual v1.2》的中的各步实验流程进行优化,选用LNA修饰、5’端地高辛标记核酸探针能在一定范围并且较高的杂交温度特异性地结合至目的microRNA上,本研究中利用80ηM浓度的miR-92a探针,于55℃中进行1小时杂交后在4℃低温2×SSC作为杂交后洗脱未结合之探针的条件,即可得出较高的杂交信号。结合原位杂交及多光谱分析方法验证结直肠肿瘤旁正常肠组织、肠腺瘤(低级别或高级别上皮内瘤变)和肠腺癌组织中miR-92a的表达差异及推测其生物学功能在24个病例中对总共34个结直肠肿瘤旁正常的肠组织、低级别及高级别上皮内瘤变,和肠腺癌组织,使用原位杂交方法检测miR-92a的表达情况,通过观察其时间性及空间性分布特征,再合并免疫组织化学检测个别指标,有助于推测其生物学功能,但原位杂交所得结果并不能准确划分表达的强弱及范围,这是涉及到miR-92a在器官及组织中广泛分布的特性,有见及此,研究中采用多光谱检测系统,通过可见光波长区分组织染料的光吸收值,再用软件进一步定量分析miR-92a的表达情况,以便了解其在各结直肠肿瘤组织中的时间性及空间性分布。结果显示利用多光谱成像系统能有效地定量检测miR-92a的杂交信号,并证实miR-92a能较好地区分肠腺癌及癌旁组织、腺癌及低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变及低级别上皮内瘤变,以及各病变的旁正常组织之间的个别检测指标中显示出一定的表达差异,但miR-92a在肠腺癌与高级别上皮内瘤变之间的表达未见显著差异。结直肠肿瘤旁正常上皮组织中miR-92a及增殖指标PCNA的表达分布特征相似在结直肠肿瘤组织旁的正常肠上皮中,miR-92a的表达呈“底多面少”的分布,这种分布的特征类似于类似于结直肠腺瘤生长模式之一的“自底向上模式”,因此推测miR-92a可能与肠隐窝中的干细胞生长及分化,利用免疫组织化学EnVision二步法检测正常肠上皮组织中在细胞增殖周期中G1,S,G2和M期时表达的增殖细胞核抗原PCNA,从形态学上显示miR-92a与PCNA之间表达分布和表达强度类似,推断miR-92a可能参与肠上皮细胞增殖和分化,但需要扩大样本量以进一步验证两者之间的关系。结直肠癌与其癌前病变中miR-92a与p53蛋白的表达呈负相关在本研究中,miR-92a于34个病例样本中的表达强度与病例中的p53蛋白临床指标有一定的相关关系。通过免疫组织化学EnVision二步法检测了各病例组织中的p53突变蛋白表达情况,再与miR-92a的表达强度比对,证实在同一病例的相同部位中,miR-92a的表达随p53蛋白的减少而增强,表明两者之间的呈高度负相关关系(Pearsonχ2值=0.94,p=0.056)。但miR-92a如何调控p53蛋白的表达,仍有待一步功能研究探索两者间的关系。