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细胞内胆固醇主要来源有两种途径,包括外源性胆固醇摄入和内源性胆固醇合成,它们均通过一个依赖于细胞内胆固醇水平的反馈调节系统的严密控制来保证胆固醇的内稳态平衡,即主要通过SCAP-SREBP2-LDLr/HMGCoA reductase通路实现对细胞内脂质稳态平衡的调节。SREBP2是一个绑定在内质网膜和核膜的含三区域的蛋白。SREBP2的NH2-末端是一个转录因子,它与一个多基因编码酶的启动子区域内的胆固醇调节元件相结合,而这一多基因编码酶在胆固醇合成和胆固醇摄取中起着决定作用。SREBPs的NH2-末端区域的蛋白水解是相继进行的,蛋白酶裂解SREBPs是由SREBP裂解激活蛋白(SCAP)所激活的。SCAP-SREBP复合物在细胞内胆固醇下降时会产生。SCAP有一个胆固醇敏感区域,在细胞内胆固醇水平增加的时候,能抑制复合物的形成,从而形成一个负反馈环。目的为建立平滑肌特异的固醇调节元件结合蛋白(SREBP)的裂解激活蛋白(SCAP)超表达转基因小鼠,深入探讨SCAP的功能,本实验构建了由平滑肌特异蛋白SM22启动子(pSM22)启动仓鼠SCAP 443位点突变体——SCAP(D443N)的真核表达质粒,并在仓鼠卵巢细胞(CHO)、肾系膜细胞(HMCL)、血管平滑肌细胞(VSMCs)上验证其表达及功能。方法1.利用巢式PCR从小鼠肝脏组织提取的基因组中扩增得到pSM22基因,利用PCR从pTK-HSV-SCAP(D443N)质粒中扩增出SCAP(D443N)后构建真核表达质粒pcDNA-SM22-SCAP(D443N)。2.采用两周龄胎鼠制备原代培养的VSMCs。3.转染pcDNA-SM22-SCAP(D443N)真核表达质粒分别至CHO细胞、HMCL细胞、VSMCs细胞,验证质粒的表达及功能。用酶学法分别检测细胞内总胆固醇(TC)水平;油红O染色观察细胞内脂质积聚情况;提取细胞总RNA,应用实时荧光定量PCR技术(real-time quantitative PCR)检测LDLr、SREBP2、SCAP、HMGCoA水平;用Western blotting法检测LDLr、SREBP2和SCAP、HMGCoA蛋白表达水平。结果1.成功构建了真核表达质粒pTK-HSV-SCAP(D443N)。2.原代VSMCs制备成功。3.SCAP过表达能够增加细胞SREBP2、LDLr及HMGCoA的mRNA的表达及蛋白表达。即使在高浓度胆固醇水平下,上述基因的合成仍然增加。通过油红O和胆固醇测定发现SCAP过表达能增加细胞内的脂质积聚。这一现象打破了LDLr的生理性负反馈调节,进而促使了泡沫细胞的形成。