循环肿瘤细胞（CTC）从原发的肿瘤组织脱落进入血液中循环,在肿瘤的早期诊断和疗效评估中起着重要作用。另一方面,过氧化氢（H₂O₂）是细胞内的第二信使,在细胞增殖、分化和迁移等方面起着重要的调节作用,同时新血管生成、氧化应激状态、老化等生理活动以及肿瘤的发生、发展都与H₂O₂息息相关。因此,如何有效识别H₂O₂信号,并利用肿瘤细胞内高浓度的H₂O₂检测循环肿瘤细胞,对肿瘤的早期诊断至关重要。近年来,一系列针对肿瘤微环境中高浓度的H₂O₂特性的响应性纳米体系被开发,并应用于成像诊断、肿瘤乏氧治疗、光动力治疗、药物控制释放等研究。因此,开发新的基于H₂O₂响应性的智能纳米体系,应用于恶性肿瘤的早期诊断,是当前生物医药领域面临的研究热点。在本文中,我们构建了一系列H₂O₂响应性纳米荧光探针,通过荧光强度的变化鉴定循环肿瘤细胞,从而实现肿瘤的早期诊断。具体研究内容和主要结论概括如下:1.“增强型”过氧化氢响应性纳米荧光探针的构建及其循环肿瘤细胞鉴定和结肠癌诊断研究由于肿瘤细胞具有高度异质性和上皮间质转化效应,传统的循环肿瘤细胞（CTC）检测很有可能会出现假阳性或者假阴性结果。因此,构建了一种基于香豆素-硼酸酯荧光分子的H₂O₂响应性纳米荧光探针（GC-Cou-Bpin）。疏水性的香豆素-硼酸酯通过酰胺化反应接枝到亲水性的乙二醇壳聚糖侧链上,形成的两亲性接枝聚合物可在水中自组装形成“增强型”纳米荧光探针。该纳米荧光探针能快速进入细胞,并与细胞内的H₂O₂反应。细胞内高浓度的H₂O₂脱除硼酸酯保护基团后,该纳米荧光探针的蓝色荧光信号发生明显增强。细胞实验证实GC-Cou-Bpin纳米荧光探针可有效对结肠癌细胞内的H₂O₂响应并荧光增强。将GC-Cou-Bpin纳米荧光探针应用于不同恶性程度的结肠癌病人循环肿瘤细胞的检测中。临床实验结果表明,GC-Cou-Bpin纳米荧光探针可有效克服由于细胞角蛋白（CK19）低表达或不表达而导致的循环肿瘤细胞检测中的假阴性结果,使CTC计数更加精确,有助于实现更加精准有效的肿瘤早期诊断。2.“比率型”过氧化氢响应性纳米荧光探针的构建及其在胃肠癌病人循环肿瘤细胞检测中的应用“增强型”H₂O₂响应性纳米荧光探针通过荧光信号的增强检测细胞内的H₂O₂浓度,在很大程度上受到了细胞对纳米荧光探针摄取量的影响。因此,为了减少细胞内纳米探针浓度对荧光信号的影响,设计了一种“比率型”H₂O₂响应性纳米荧光探针,可用于半定量检测肿瘤细胞内的H₂O₂浓度。在亲水性的乙二醇壳聚糖侧链上引入疏水性的H₂O₂响应性香豆素-硼酸酯琥珀酰亚胺酯探针和内标探针罗丹明B,制备得到两亲性GC-Cou-Bpin-RhB接枝聚合物,可在水中自组装形成“比率型”纳米荧光探针。该纳米荧光探针中,内标探针罗丹明B的荧光强度不受H₂O₂的影响,而香豆素-硼酸酯在H₂O₂作用下,其蓝色荧光信号发生明显增强。将GC-Cou-Bpin-RhB纳米荧光探针应用于结肠癌肿瘤细胞内H₂O₂浓度的半定量检测,并应用于临床中鉴定胃肠癌病人的循环肿瘤细胞。临床实验结果表明,“比率型”H₂O₂响应性纳米荧光探针可有效克服纳米探针进入细胞的浓度不同而产生的影响,更加准确地反应循环肿瘤细胞内的H₂O₂浓度。与此同时,通过“比率型”H₂O₂响应性纳米荧光探针中内标探针RhB的荧光强度,可以鉴定有活力的CTC和凋亡CTC,辅助临床上肿瘤病人的早期诊断。3.“靶向型”过氧化氢响应性纳米荧光探针的构建及其在胰腺癌诊断中的应用外周血中只有少数几个循环肿瘤细胞,却有成千上万个白细胞,大量的白细胞给循环肿瘤细胞的检测带来极大的干扰。因此,为了提高H₂O₂响应性纳米荧光探针的检测效率并减少白细胞的干扰,设计合成了一种CD44靶向的“靶向型”H₂O₂响应性纳米荧光探针。该纳米探针可特异性地检测CD44高表达的肿瘤细胞内的H₂O₂。将疏水的H₂O₂响应性的萘酰亚胺-硼酸酯荧光小分子在缩合剂4-（4,6-二甲氧基三嗪-2-基）-4-甲基吗啉盐酸盐（DMTMM）的作用下接枝到亲水的透明质酸侧链上,形成两亲性的透明质酸—萘酰亚胺-硼酸酯接枝聚合物（HA-NP-BE）,可在水中自组装形成“靶向型”纳米荧光探针。细胞实验证实,通过透明质酸和胰腺癌肿瘤表面高表达的CD44抗原特异性结合,HA-NP-BE纳米荧光探针可以靶向性地进入胰腺癌肿瘤细胞,检测其细胞内的H₂O₂并对其成像。此外,白细胞由于CD44低表达,HA-NP-BE纳米荧光探针无法被白细胞摄取,大大增加了纳米荧光探针的检测效率。临床实验表明,HA-NP-BE纳米荧光探针可以高效地检测出胰腺癌肿瘤病人中的循环肿瘤细胞。