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植物在各个生长发育阶段以及对各种环境胁迫响应的过程中,都需要通过各种复杂的信号传导途径对生命活动进行及时而准确的调节。由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白质的可逆磷酸化在植物信号转导和生理代谢过程中起重要的调节作用。蛋白磷酸酯酶2C(PP2C)是蛋白磷酸酶中的重要组成部分,与植物的生长发育、细胞周期调节、信号转导及环境胁迫应答等各种生物学过程密切相关。其中,ABI1等A类PP2C是拟南芥中ABA信号转导途径的重要负调控因子,参与调节ABA诱导的气孔关闭和基因表达等多种信号反应。对ABI1的性质和功能进行研究对深入理解ABA信号转导的调控机制具有重要的意义。本研究根据拟南芥ABI1基因的序列,采用同源克隆法及RACE技术分离获得白菜(Brassica campestrisL.ssp.chinensis Makino) BcABI1基因的全长序列,分析其序列特征并预测其蛋白质的功能;在十字花科植物中扩增其同源基因并进行系统进化研究;通过实时荧光定量PCR分析该基因的时空表达特征。取得了如下主要研究结果:
(1)利用同源克隆及RACE技术相结合的方法分离获得了白菜ABI1基因——BcABI1的eDNA和DNA全长序列。白菜BcABI1基因的最大开放阅读框为1242 bp,G+C含量为53.4%,A+T含量为46.6%,编码413个氨基酸。DNA序列中包含3个内含子,长度分别为101bp、98bp和73bp。BcABI1蛋白含有一个PP2C的催化结构域,其中151~159之间的氨基酸序列FFGVYDGHG是非常保守的活性位点。与拟南芥AtABI1的氨基酸序列比对发现,两种蛋白质C端催化部位相似性非常高,N端延伸区则存在着显著差异。由此推测,BcABI1与AtABI1具有相似的功能,也参与调控多种ABA信号反应,但N端延伸区序列的差异是否会导致BcABI1功能的变化,还需今后进一步的研究证实。
(2)在十字花科不同种属的23个品种植物中对ABI1同源基因进行了扩增,获得其基因组序列的长度为1480~1681bp。所有ABI1同源基因均含三个内含子,具有植物PP2C基因的典型结构特征,核苷酸序列的相似性很高,说明BcABI1基因非常保守,因此推测,BcABI1的功能较为保守,在植物生长发育过程中发挥着重要的作用。进一步的序列分析发现,不同属间ABI1同源基因的DNA序列差异大于属内序列的差异。属内、不同属间氨基酸序列上的差异比核苷酸序列的差异要小得多。系统进化树结果表明,芸薹属与萝卜属的亲缘关系较近,与诸葛菜属的亲缘关系较远,与拟南芥最远。
(3)利用实时定量PCR分析白菜BcABI1基因在不同组织中的表达情况,发现该基因有组成型表达特点,其中,在开放花中的表达量最高,茎中表达量最低,在叶片和角果嫩中的表达量也较高,该研究结果表明,BcABI1可能在白菜整个生长发育过程中都发挥着重要的作用。ABA处理后BcABI1表达量变化明显,表现为先迅速增高,在4h时表达量达到最大,而后逐渐降低至正常水平。不同浓度ABA对BcA BI1表达的影响效果不同,其中以100μmol·L-1处理的效果最明显。NaCl处理后,白菜叶片中BcABI1的表达量先持续升高,到处理的第8h时其表达量达到最高,而后逐渐降低,至24 h后仍保持较高的表达量,说明BcABI1参与了白菜渗透胁迫的响应过程。针刺处理后BcABI1的表达量与对照相比没有明显的变化。在核盘菌和灰霉菌接种处理后,白菜叶片中BcABI1的表达量变化趋势一致,均表现出先降低而后缓慢升高的特点,与非生物胁迫中的表达变化趋势有显著差异。