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背景：
邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(di(2-ethylhexy1)phthalate, DEHP)是一种公认的环境内分泌干扰物(environmental endocrine disrupting chemicals, EEDs)，因其具有良好的软化塑料的效果，被广泛用作增塑剂，对人体有明显的生殖毒性和神经毒性。通过口服方式摄入的DEHP，通过利用胃肠道中的肠酯酶快速脱酯转变成它的主要毒性代谢产物邻苯二甲酸单乙基己酯(mono(2-ethylhexyl)phthalate, MEHP)，进一步在人体多种器官内分布和富集，发挥毒害作用。
乳化剂是一种能够改变悬浊液中各种物质表面张力从而使其均匀稳定的物质，因其具有良好的乳化、增溶、润湿、消泡等功效，被广泛用作药物载体和食品添加剂。聚山梨醇酯80(polysorbate 80，P80)是一种典型的非离子型表面活性剂，乳化剂P80能够增加肠上皮细胞渗透性，导致了人体对包括塑化剂DEHP在内的多种外源性物质的摄取能力也随之增加。然而，目前关于乳化剂P80如何促进塑化剂DEHP的在体吸收仍然存在很大空白。天然乳化剂大豆卵磷脂(lecithin)是从生产大豆油的油脚中提取的产物，具有很高的营养价值，被广泛认为能够在预防疾病发生方面起到重要作用。
肠道菌群作为人体庞大的消化微生态系统，是口服摄入物质被人体吸收的必经之路。肠道菌群种类繁多，约有500~1000种，其中拟杆菌门和厚壁菌门的菌群占据总菌群量的90%~95%，是人体最主要的菌群。肠道菌群长期定居在宿主肠腔或粘附在上皮表面的粘液胶中，从宿主吸收生长所需的营养物质，同时对宿主的生理状况产生影响，肠道菌群的稳态平衡与人体健康息息相关。
实验目的：
利用本课题组设计合成的新型荧光探针MEHP-AF，在添加了低剂量的乳化剂P80的饮食条件下，模拟塑化剂MEHP的在体吸收，同时探究乳化剂P80促进塑化剂MEHP吸收的机制，揭示乳化剂P80、塑化剂MEHP与肠道菌群三者之间的关系。
实验方法：
1.MEHP-AF的毒效和毒代
我们使用六周龄的雄性ICR小鼠作为实验动物，随机分组给予乳化剂P80/乳化剂大豆卵磷脂或塑化剂MEHP-AF或乳化剂联合塑化剂MEHP-AF，并设置完全空白对照组和玉米油溶剂对照组，实验周期为两周。两周后，取小鼠眼静脉丛血，处死并解剖小鼠，取心、肝、脾、肺、肾、睾丸等器官，观察MEHP-AF的血药浓度和器官毒性作用。此外，取十二指肠、空肠和回肠组织，制备冰冻切片观察MEHP-AF在肠道中的富集情况。同时，制备肠道组织石蜡切片，使用HE(hematoxylin&eosin)染色和AB-PAS(alcian blue and periodic acid-Schiff)复染技术，观察肠道的病理变化。最后制备睾丸组织石蜡切片，进行HE染色和TUNEL检测，观察MEHP-AF的生殖毒性。
2.16SrRNA基因测序分析和非靶向代谢组学分析
我们收集上述小鼠结肠中的粪便，按照使用说明使用QIAampMiniDNAstoolkit提取小鼠粪便中的DNA。纯化后，利用IlluminaMiSeqplatform进行16SrRNA基因测序分析，分析观察乳化剂P80对小鼠肠道菌群的影响。
将上述小鼠肠道菌群进行体外培养，使用溶菌酶进行常温下裂解，并将裂解物进行非靶向代谢组学鉴定，找出各组之间显著差异的代谢物质。
3.MEHP-AF的细胞摄取
我们选择的模式细胞为人结肠腺癌细胞(Caco-2)和人结肠癌细胞(HT-29)，将乳化剂P80/乳化剂大豆卵磷脂改变后的小鼠肠道菌群的裂解物或培养肠道菌群的上清液与上述各个细胞株共同孵育，再加入塑化剂MEHP-AF，90min后在激光共聚焦荧光显微镜下观察细胞摄取MEHP-AF的情况，判断各组肠道菌群裂解物是否促进了MEHP-AF的吸收。
4.无菌小鼠粪菌移植实验
收集并培养上述乳化剂组小鼠的肠道菌群，利用粪菌移植技术(fecal microbiota transplantation, FMT)将肠道菌定植到六周龄雄性ICR无菌小鼠体内。定植后，对无菌小鼠进行两周的塑化剂MEHP-AF灌胃实验，两周后，参照上述实验方法和技术，检测乳化剂组小鼠肠道菌群定植对无菌小鼠吸收MEHP-AF的影响。
实验结果：
1.MEHP-AF的毒效和毒代
检测各组血浆中MEHP-AF浓度，结果发现乳化剂P80联合MEHP-AF处理组小鼠血浆中MEHP-AF浓度显著高于其他各组，而乳化剂大豆卵磷脂则没有对MEHP-AF的血浆内吸收起到明显的促进作用。各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾等器官并未观察到显著损伤。免疫荧光结果显示，乳化剂P80的添加促进了MEHP-AF在小鼠小肠中的富集。病理切片结果显示，乳化剂P80联合MEHP-AF处理组小鼠的肠道病变明显，粘液屏障和粘膜屏障受损严重，小鼠的睾丸组织也表现有更大程度的损伤，成熟精细胞数量减少，精细胞凋亡数增加。
2.16SrRNA基因测序分析和非靶向代谢组学分析
基于16SrRNA基因测序分析结果，添加乳化剂P80处理组的小鼠肠道菌群丰度显著低于其他各组，乳化剂P80显著改变了小鼠肠道菌群组成，具体表现有更丰富的拟杆菌科(Bacteroidaceae)和瘤胃球菌([Ruminococcus] gnavus group)，而Muribaculaceae和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)的丰度则显著降低。而天然乳化剂大豆卵磷脂添加组的小鼠肠道菌群结构则与对照组类似。
基于非靶向代谢组学分析结果，乳化剂P80和大豆卵磷脂改变的肠道菌裂解物中的代谢物整体上相似，都表现有硫酸盐(sulfate)和十二烷基硫酸钠(dodecyl sulfate)的高表达。此外，乳化剂P80组的肠道菌裂解物的代谢物中检测到了明显降低的与粘液形成相关的N5-乙基-L-谷氨酰胺(N5-Ethyl-L-glutamine)，与小肠病理切片观察到的粘液屏障破坏的现象高度一致。也就是说，乳化剂能够显著地改变小鼠肠道菌群的代谢物。
3.MEHP-AF的细胞摄取
乳化剂P80改变的肠道菌群的裂解物与Caco-2细胞共同孵育后，显著促进了Caco-2细胞对MEHP-AF的摄取，而培养肠道菌群的上清液没有表现出促进吸收的作用。此外，使用乳化剂P80改变的肠道菌群的裂解物孵育后的HT-29细胞内Mucin-2蛋白显著减少。乳化剂大豆卵磷脂改变的肠道菌群的裂解物和上清液均未对两种细胞株吸收MEHP-AF产生明显影响。
4.无菌小鼠粪菌移植实验
各组无菌小鼠的实验结果均与上述结果相似，定植了乳化剂P80组小鼠肠道菌的小鼠血浆中MEHP-AF浓度更高，小肠中MEHP-AF富集程度更重，结肠组织显示出大量炎症细胞浸润，说明乳化剂改变的肠道菌群确实是促进MEHP-AF吸收的一大关键因素。
结论：
非离子型乳化剂P80能够影响小鼠肠道屏障结构、改变肠道菌群组成和菌群代谢物，促进塑化剂MEHP在小鼠体内的吸收。
邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(di(2-ethylhexy1)phthalate, DEHP)是一种公认的环境内分泌干扰物(environmental endocrine disrupting chemicals, EEDs)，因其具有良好的软化塑料的效果，被广泛用作增塑剂，对人体有明显的生殖毒性和神经毒性。通过口服方式摄入的DEHP，通过利用胃肠道中的肠酯酶快速脱酯转变成它的主要毒性代谢产物邻苯二甲酸单乙基己酯(mono(2-ethylhexyl)phthalate, MEHP)，进一步在人体多种器官内分布和富集，发挥毒害作用。
乳化剂是一种能够改变悬浊液中各种物质表面张力从而使其均匀稳定的物质，因其具有良好的乳化、增溶、润湿、消泡等功效，被广泛用作药物载体和食品添加剂。聚山梨醇酯80(polysorbate 80，P80)是一种典型的非离子型表面活性剂，乳化剂P80能够增加肠上皮细胞渗透性，导致了人体对包括塑化剂DEHP在内的多种外源性物质的摄取能力也随之增加。然而，目前关于乳化剂P80如何促进塑化剂DEHP的在体吸收仍然存在很大空白。天然乳化剂大豆卵磷脂(lecithin)是从生产大豆油的油脚中提取的产物，具有很高的营养价值，被广泛认为能够在预防疾病发生方面起到重要作用。
肠道菌群作为人体庞大的消化微生态系统，是口服摄入物质被人体吸收的必经之路。肠道菌群种类繁多，约有500~1000种，其中拟杆菌门和厚壁菌门的菌群占据总菌群量的90%~95%，是人体最主要的菌群。肠道菌群长期定居在宿主肠腔或粘附在上皮表面的粘液胶中，从宿主吸收生长所需的营养物质，同时对宿主的生理状况产生影响，肠道菌群的稳态平衡与人体健康息息相关。
实验目的：
利用本课题组设计合成的新型荧光探针MEHP-AF，在添加了低剂量的乳化剂P80的饮食条件下，模拟塑化剂MEHP的在体吸收，同时探究乳化剂P80促进塑化剂MEHP吸收的机制，揭示乳化剂P80、塑化剂MEHP与肠道菌群三者之间的关系。
实验方法：
1.MEHP-AF的毒效和毒代
我们使用六周龄的雄性ICR小鼠作为实验动物，随机分组给予乳化剂P80/乳化剂大豆卵磷脂或塑化剂MEHP-AF或乳化剂联合塑化剂MEHP-AF，并设置完全空白对照组和玉米油溶剂对照组，实验周期为两周。两周后，取小鼠眼静脉丛血，处死并解剖小鼠，取心、肝、脾、肺、肾、睾丸等器官，观察MEHP-AF的血药浓度和器官毒性作用。此外，取十二指肠、空肠和回肠组织，制备冰冻切片观察MEHP-AF在肠道中的富集情况。同时，制备肠道组织石蜡切片，使用HE(hematoxylin&eosin)染色和AB-PAS(alcian blue and periodic acid-Schiff)复染技术，观察肠道的病理变化。最后制备睾丸组织石蜡切片，进行HE染色和TUNEL检测，观察MEHP-AF的生殖毒性。
2.16SrRNA基因测序分析和非靶向代谢组学分析
我们收集上述小鼠结肠中的粪便，按照使用说明使用QIAampMiniDNAstoolkit提取小鼠粪便中的DNA。纯化后，利用IlluminaMiSeqplatform进行16SrRNA基因测序分析，分析观察乳化剂P80对小鼠肠道菌群的影响。
将上述小鼠肠道菌群进行体外培养，使用溶菌酶进行常温下裂解，并将裂解物进行非靶向代谢组学鉴定，找出各组之间显著差异的代谢物质。
3.MEHP-AF的细胞摄取
我们选择的模式细胞为人结肠腺癌细胞(Caco-2)和人结肠癌细胞(HT-29)，将乳化剂P80/乳化剂大豆卵磷脂改变后的小鼠肠道菌群的裂解物或培养肠道菌群的上清液与上述各个细胞株共同孵育，再加入塑化剂MEHP-AF，90min后在激光共聚焦荧光显微镜下观察细胞摄取MEHP-AF的情况，判断各组肠道菌群裂解物是否促进了MEHP-AF的吸收。
4.无菌小鼠粪菌移植实验
收集并培养上述乳化剂组小鼠的肠道菌群，利用粪菌移植技术(fecal microbiota transplantation, FMT)将肠道菌定植到六周龄雄性ICR无菌小鼠体内。定植后，对无菌小鼠进行两周的塑化剂MEHP-AF灌胃实验，两周后，参照上述实验方法和技术，检测乳化剂组小鼠肠道菌群定植对无菌小鼠吸收MEHP-AF的影响。
实验结果：
1.MEHP-AF的毒效和毒代
检测各组血浆中MEHP-AF浓度，结果发现乳化剂P80联合MEHP-AF处理组小鼠血浆中MEHP-AF浓度显著高于其他各组，而乳化剂大豆卵磷脂则没有对MEHP-AF的血浆内吸收起到明显的促进作用。各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾等器官并未观察到显著损伤。免疫荧光结果显示，乳化剂P80的添加促进了MEHP-AF在小鼠小肠中的富集。病理切片结果显示，乳化剂P80联合MEHP-AF处理组小鼠的肠道病变明显，粘液屏障和粘膜屏障受损严重，小鼠的睾丸组织也表现有更大程度的损伤，成熟精细胞数量减少，精细胞凋亡数增加。
2.16SrRNA基因测序分析和非靶向代谢组学分析
基于16SrRNA基因测序分析结果，添加乳化剂P80处理组的小鼠肠道菌群丰度显著低于其他各组，乳化剂P80显著改变了小鼠肠道菌群组成，具体表现有更丰富的拟杆菌科(Bacteroidaceae)和瘤胃球菌([Ruminococcus] gnavus group)，而Muribaculaceae和普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)的丰度则显著降低。而天然乳化剂大豆卵磷脂添加组的小鼠肠道菌群结构则与对照组类似。
基于非靶向代谢组学分析结果，乳化剂P80和大豆卵磷脂改变的肠道菌裂解物中的代谢物整体上相似，都表现有硫酸盐(sulfate)和十二烷基硫酸钠(dodecyl sulfate)的高表达。此外，乳化剂P80组的肠道菌裂解物的代谢物中检测到了明显降低的与粘液形成相关的N5-乙基-L-谷氨酰胺(N5-Ethyl-L-glutamine)，与小肠病理切片观察到的粘液屏障破坏的现象高度一致。也就是说，乳化剂能够显著地改变小鼠肠道菌群的代谢物。
3.MEHP-AF的细胞摄取
乳化剂P80改变的肠道菌群的裂解物与Caco-2细胞共同孵育后，显著促进了Caco-2细胞对MEHP-AF的摄取，而培养肠道菌群的上清液没有表现出促进吸收的作用。此外，使用乳化剂P80改变的肠道菌群的裂解物孵育后的HT-29细胞内Mucin-2蛋白显著减少。乳化剂大豆卵磷脂改变的肠道菌群的裂解物和上清液均未对两种细胞株吸收MEHP-AF产生明显影响。
4.无菌小鼠粪菌移植实验
各组无菌小鼠的实验结果均与上述结果相似，定植了乳化剂P80组小鼠肠道菌的小鼠血浆中MEHP-AF浓度更高，小肠中MEHP-AF富集程度更重，结肠组织显示出大量炎症细胞浸润，说明乳化剂改变的肠道菌群确实是促进MEHP-AF吸收的一大关键因素。
结论：
非离子型乳化剂P80能够影响小鼠肠道屏障结构、改变肠道菌群组成和菌群代谢物，促进塑化剂MEHP在小鼠体内的吸收。