【摘 要】
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灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）是一种寄主广泛,危害严重的植物致病菌,严重影响全球许多地区的农业经济发展,因此了解其相关基因的功能以及致病机理具有重要的意义。灰葡萄孢细
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灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）是一种寄主广泛,危害严重的植物致病菌,严重影响全球许多地区的农业经济发展,因此了解其相关基因的功能以及致病机理具有重要的意义。灰葡萄孢细胞壁合成的相关基因在灰葡萄孢的生长繁殖和侵染过程中都有重要作用,本实验通过筛选得到了几株与灰葡萄孢细胞壁完整性有关的缺陷突变株,并对相关基因功能进行了初步研究。本实验首先以灰葡萄孢单倍体菌株B05.10为实验基础,利用农杆菌AGL1介导的遗传转化法,得到249株稳定遗传的具有潮霉素抗性基因的T-DNA插入突变株。再利用荧光增白剂Calcofluor White（CFW）筛选细胞壁完整性缺陷的T-DNA插入突变株,筛选得到8株细胞壁完整性缺陷突变株,即7株敏感性突变株（D-9、D-59、D-122、D-125、D-153、D-241、D-286）和 1 株抗性突变株（D-2）。通过对潮霉素抗性基因的鉴定证实上述8株突变株的基因组DNA中均有T-DNA插入。本实验利用TAIL-PCR技术扩增上述8株转化子的T-DNA插入位点的侧翼序列,并通过对侧翼序列进行序列分析和BLAST搜索确定了 8株突变株中T-DNA的插入位点。其中分析结果显示有3株突变株具有研究的价值,即D-2、D-9、D-59。通过RT-PCR验证插入位点相关基因表达情况,结果显示突变株D-59的T-DNA插入位点相关基因BCLG-00770.1未能正常表达,说明该基因由于T-DNA的插入而失活。随后利用Southern blot分析确定了突变株D-59属于T-DNA单拷贝插入突变。为了研究BCLG-00770.1的基因功能,本实验构建了突变株D-59的基因互补菌株。通过对野生型菌株、突变株D-59以及互补菌株的生物学特性分析,发现基因BCLG00770.1对灰葡萄孢菌的孢子形成、孢子萌发、几丁质合成、侵染能力均有影响。由于该基因属于未知功能基因,对该基因功能的解析还需要全面的、系统的研究。
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