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背景:弓形虫是专性的细胞内寄生原虫,它能够感染几乎所有的温血动物,包括人。许多研究已经证实弓形虫是一种嗜神经的寄生虫。当宿主感染弓形虫后,弓形虫速殖子随血流进入宿主多个器官和组织。在宿主免疫力正常的情况下,速殖子感染一个月后便在宿主脑组织中形成包囊。有研究表明,弓形虫速殖子可感染宿主中枢神经系统所有的有核细胞,并激活大脑中的小胶质细胞和星形胶质细胞,分泌大量的炎性细胞因子。有证据表明,弓形虫可以直接调节NF-κB途径而弓形虫效应分子GRA15II在该调节中起关键作用。近年来,已经发现我国弓形虫的主要基因型是Chinese 1(Toxo DB#9),并同时具有GRA15II和ROP16I/III效应分子。WH6虫株是Chinese1基因型弓形虫之一,称为弓形虫Chinese 1型Wh6虫株(Wh6strain of T.gondii Type Chinese 1,Tg Ctwh6)。有研究表明弓形虫包囊主要分布在大脑体感皮层、运动皮层和海马区中,而且弓形虫的慢性感染也可逐渐影响神经元的功能。这表明弓形虫感染可能会导致宿主神经精神异常和运动障碍。进一步研究表明,弓形虫感染后的第7天,可以通过“特洛伊木马机制”穿过血脑屏障,到达中枢神经系统并感染神经元,从而触发一系列神经精神疾病,例如精神分裂症,癫痫,抑郁症甚至阿尔茨海默氏病等,但目前国内外尚无Tg Ctwh6对脑组织感染及其产生神经精神异常的研究。目的:探讨Tg Ctwh6感染对小鼠认知行为的影响,并从海马区神经元凋亡和产生Aβ沉积的角度研究这种影响的细胞和分子机制。方法:首先,构建慢性感染Tg Ctwh6的BALB/c小鼠模型,然后将小鼠随机分为对照组(生理盐水组)和Tg Ctwh6感染组。Tg Ctwh6感染8周后对小鼠进行体表形态的观察和脑组织压片镜检弓形虫包囊,以观察小鼠体态行为的改变和确定建模是否成功。然后,通过水迷宫、旷场实验检测被Tg Ctwh6感染后的小鼠认知行为改变情况;通过HE、尼氏染色检和WB检测Tg Ctwh6感染后的小鼠脑组织海马区神经元细胞排列、大小、数量及核膜改变的情况和海马神经元突触蛋白Synaptotagmin1的表达情况;通过免疫组化和硫磺素染色检测Tg Ctwh6感染后的小鼠海马区Aβ沉积及分布情况;通过WB和q RT-PCR检测Tg Ctwh6感染后的小鼠海马区组织中BACE1、APP蛋白和基因表达情况。为了研究Tg Ctwh6感染导致小鼠海马区神经元数量减少、形态改变及Aβ沉积的机制,我们用细胞实验进一步进行体外研究。利用Tg Ctwh6速殖子直接感染海马神经元细胞株HT22,通过WB检测HT22内的凋亡相关蛋白Bax、Caspase 3和Bcl-XL表达情况以及突触蛋白Synaptotagmin1的表达情况以明确HT22是否凋亡,突触是否损坏,是否对记忆力造成损伤;通过WB、q RT-PCR及免疫荧光染色检测HT22内的BACE1、APP及Aβ在蛋白和基因水平的表达情况。为了了解Tg Ctwh6速殖子感染HT22后导致细胞内Aβ沉积的分子机制,我们用WB和免疫荧光染色检测感染后的HT22在有或无NF-κB信号转导通路特效抑制剂PDTC预处理情况下细胞内NF-κB p65、p-NF-κBp65、BACE1、APP和Aβ蛋白的表达情况。为了弄清Tg Ctwh6感染是否可以通过小胶质细胞的激活而间接作用于海马区神经元,使后者凋亡并产生Aβ沉积,我们利用Transwell系统对小胶质细胞株BV2和HT22进行了共培养实验。首先通过流式细胞技术检测被感染的BV2是否被激活为M1,然后用WB检测BV2细胞Notch信号通路中的Hes1和Notch两个关键性的信号蛋白表达情况。明确BV2被Tg Ctwh6速殖子感染而激活后,我们用q RT-PCR检测Transwell系统上层BV2内的IL-6、TNF-α、i NOS和TGF-β1炎性因子在基因水平的表达情况。随后我们取Transwell系统下层中的HT22,用WB检测HT22内的凋亡相关蛋白Bax、Caspase 3和Bcl-XL表达情况,并用流式细胞技术检测HT22凋亡率;同时,我们还用WB检测了HT22内的APP蛋白表达水平,以了解Tg Ctwh6速殖子感染BV2后是否可以间接影响HT22的凋亡和Aβ的产生。结果:1.体内实验表明:(1)Tg Ctwh6感染导致小鼠认知行为的损害;(2)Tg Ctwh6感染引起小鼠海马区神经元数量较少、体积变小、排列紊乱伴随着神经元突触减少;(3)Tg Ctwh6感染使小鼠海马区Aβ沉积。2.体外实验表明:(1)Tg Ctwh6速殖子感染HT22后直接导致其凋亡和神经元突触减少;(2)Tg Ctwh6速殖子感染HT22后通过NF-κB信号通路直接导致其分泌过多的Aβ;(3)Tg Ctwh6速殖子感染BV2后通过Notch信号通路诱导其向M1极化,后者分泌的促炎性因子导致HT22凋亡和Aβ过量分泌,即Tg Ctwh6速殖子可通过间接方式作用于HT22,使其凋亡并分泌APP。结论:本研究提示,我国特有且占优势基因型的弓形虫Tg Ctwh6感染小鼠后导致小鼠认知行为异常,其机制可能在于Tg Ctwh6速殖子不仅直接促使小鼠海马区神经元凋亡并通过NF-κB信号通路直接诱导海马区神经元产生大量Aβ,而且还通过Notch信号通路使被感染的小胶质细胞激活为M1,以间接促使海马区神经元凋亡并产生Aβ,即Tg Ctwh6感染小鼠所致的认知行为异常可能系Tg Ctwh6对小鼠海马区神经元直接和间接作用的结果。本研究初步揭示了Tg Ctwh6介导的小鼠认知行为损害的机制,使我们对我国特有的弓形虫感染导致的认知障碍有了进一步认识,为今后防治我国弓形虫引起的认知行为障碍疾病,包括阿尔茨海默氏病提供了实验和理论基础。