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石刁柏(Asparagus officinalis)是一种广泛栽培的经济作物,同时也是研究性别决定机制的模式植物之一。但是对于其性别决定的分子机制,尤其是其单性性别决定及发育相关基因目前仍不清楚。本研究以石刁柏为材料,在高通量转录组测序数据的基础上,利用生物信息学、RT-PCR、荧光定量PCR、RACE及组织原位杂交技术分析了石刁柏雌雄性别差异表达基因,并对其中3个稳定的性别发育相关基因进行了克隆和表达分析。主要研究结果如下:1、以发育早期的雌雄花为材料,利用Illumina双末端测序技术进行转录组测序,经过整理后得到260 G高质量数据,组装获得平均长度为979 bp的unigenes 72,626个。通过对雌性、雄性和超雄株转录组数据比较分析后获得性别差异表达基因4876个。其中,433个差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)与花的发育相关,包括了285个雄性/超雄性偏向和149个雌性偏向基因。在雄性/超雄偏向表达基因中,102个DEGs可能与花药发育相关。此外,我们发现了43个性别差异表达基因和调控性别发育的激素调节和生物合成相关;在性别差异表达的基因中包括128个转录因子,说明转录因子可能在石刁柏性别决定和分化调控网络中发挥重要作用。2、为了验证所获得的性别差异表达基因的稳定性,我们随机对30个性别差异表达基因进行了根、茎、花和叶的逆转录PCR和荧光定量PCR表达分析。结果表明,有26个性别差异表达基因的结果和测序结果是一致的,包括20个雄性差异和6个雌性差异基因,其中8个雄性差异基因仅在雄花中表达,12个基因在雌花和雌株的其他组织中有少量的表达;6个雌性差异基因在雄花和雌花中均有表达,在雌花的表达量远远高于雄花。3、为了进一步获得性别发育相关基因的全长cDNA序列,我们利用cDNA末端快速扩增技术从26个稳定的差异表达基因中选择5个进行全长基因克隆。结果表明,5个基因中成功获得3个基因的全长cDNA序列,分别命名为AoM1、AoM2和AoM10。3个基因的cDNA全长分别为669 bp、1435 bp和1884 bp,编码141、382和532个氨基酸。AoM2编码了III型聚酮化合物合酶B-类,基因AoM10编码了糖载体蛋白C-类。通过和刚公布的石刁柏基因组序列进行mapping分析发现,AoM2基因位于4号染色体上,包含5个外显子6内含子,基因全长3732 bp。AoM10基因位于5号染色体上,包括5个内含子和6个外显子,基因全长3241 bp。AoM1未检索到。4、利用组织原位杂交技术对基因AoM1、AoM2和AoM10在花发育过程中的表达进行分析。结果表明,AoM1基因只在雄性花蕾中有杂交信号,在雄花的雌蕊和花药部分信号较强,说明该基因是典型的雄性发育促进和雌花发育的抑制基因。AoM2基因在雄花的雌蕊和雄蕊部分上有明显的杂交信号,在雌花的花托也存在信号,并且在雌花的雄蕊和雄蕊上有微弱的信号。AoM10在雄花的信号强度大于雌花,其信号都集中在花的雌蕊和雄蕊位置。这说明AoM2和AoM10是两个雌雄差异表达基因,可能参与了雌雄蕊的发育调控。