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柱花草(Stylosanthes guianensis cv.)是迄今为止世界上最优秀的热带豆科牧草,有热带牧草“希望之星”之称。该牧草喜温暖潮湿的热带气候,适于北纬23度以南,年降雨量1000毫米以上的地区生长,极易受到冷害的影响,最适宜生长温度为25~28℃,19℃时种子产量便受到严重影响。本研究应用基因工程手段将抗寒功能基因和抗寒调控基因导入柱花草中,进行柱花草品质改良,这对柱花草抵制寒害及扩大优质柱花草的种植范围具有现实意义。本研究从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中克隆到抗寒相关基因CBF3(C-repeat Binding Factor 3)、AtGols3(Arabidopsis thaliana Galactinol Synthase 3),序列进行测定后与载体pVKH相连构建植物表达载体pVKH-35S-CBF3-pA、pVKH-35S-AtGolS3-pA及各自带有35S启动子及pA终止子的双价植物表达载体pVKH-35S-CBF3-pA -35S-AtGolS3-pA。将以上三种重组质粒转入农杆菌GV3103中,以该工程菌对柱花草和拟南芥进行转化试验。选用优质的热研5号柱花草下胚轴为外植体,经预培养、农杆菌侵染、共培养后,然后将外植体转接至含有羧苄青霉素(Carb)500mg/L、头孢霉素(Cef)200mg/L、潮霉素(Hyg)40mg/L的培养基上诱导愈伤、组织分化及伸长后切取小苗转到不加抗性的生根培养基中,约20d左右生根,移入土中栽培。本实验共获得22株转AtGolS3基因抗性再生植株, 7株转CBF3基因抗性植株。任取10株转AtGolS3基因的抗性植株经PCR检测,有8株检测到有目的条带;7株转CBF3基因抗性植株中有4株检测到有目的条带。进一步进行Southern杂交实验,有6株转AtGolS3基因植株有杂交信号,表明目的基因已经导入柱花草。利用真空抽滤法将三种重组质粒导入拟南芥中。经50mg/L的潮霉素(Hyg)抗性筛选,得到T4代单拷贝插入纯合子植株。本研究旨在探讨单个基因转入与双价基因转入后植株抗寒性的差别,最关键的是今后应在此基础上进一步研究双价载体中两个基因编码的蛋白在植株代谢途径中的相互关系等。