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背景和目的喉癌是耳鼻喉科最常见的恶性肿瘤,它占耳鼻喉科恶性肿瘤的11%～22%,病理上约有95%～99%为鳞状细胞癌。尽管随着科技的发展,早期诊断技术不断提高,但临床晚期病例仍占45.2%左右。传统上以根治性手术、放疗为主,5年生存率为30%～50%。本世纪80年代以来随着药物的研究进展,喉癌的治疗特别是晚期肿瘤多主张手术、放疗、化疗和免疫治疗的联合应用。近几年来,大量研究证实多西紫杉醇用于头颈部肿瘤的治疗已取得令人鼓舞的初步疗效,单独或联合其他抗癌药物的有效率可达到22%～75%。然而,肿瘤化疗耐药的产生已经成为影响其进一步治疗效果的重要因素。目前,肿瘤细胞对化疗药物的耐药机制尚不明了。近年来的研究认为,凋亡是化疗药物诱导肿瘤细胞死亡的主要模式,而药物作用后肿瘤细胞发生的凋亡调节的改变可能是药物耐药产生的重要因素。细胞凋亡抑制蛋白家族（inhibitor ofapoptosisprotein,IAP）在调节肿瘤细胞对凋亡的敏感性方面起着核心作用。survivin是凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protien,IAP）家族中最受重视的一名新成员。survivin的分布不同于家族中其他成员,它只分布在胚胎组织和肿瘤组织,且在不同细胞系中表达量和亚细胞定位不同,也是迄今为止分子量最小、抗凋亡作用最强的IAP。它通过抑制半胱氨酸蛋白酶caspase末端效应因子caspase3、7的活性,从而抑制细胞凋亡。近年来survivin基因参与肿瘤的演变、诊断、治疗以及抗肿瘤药物耐药的机制成为了研究的热点。本研究选择了多西紫杉醇体外作用人喉癌细胞系Hep-2细胞,观察用药不同时间点及浓度下喉癌细胞内survivin mRNA表达的变化,结合诱导喉癌细胞凋亡的情况,分析survivin基因与药物诱导的喉癌细胞凋亡之间的关系,进而探讨survivin基因表达的改变与喉癌细胞化疗耐药的关系。方法体外培养喉癌细胞系Hep-2细胞,待细胞进入对数生长期后进行实验。多西紫杉醇由原液稀释成2000μg/ml浓度后开始作连续倍比稀释,作7个浓度梯度,应用MTT比色法检测不同药物浓度对Hep-2细胞体外生长的抑制作用,计算出药物24h、48h对细胞的半数抑制浓度(IC50),并根据药物的IC50,选择2IC50和1/2IC50作为高、低两个浓度作用于细胞。应用RT-PCR技术检测物高浓度处理24h,低浓度处理12、24、48h后存活Hep-2细胞中survivin mRNA的表达水平。利用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况,以凋亡指数（AI）表示凋亡状态。同时应用RT-PCR技术扩增survivin基因,显示不同时间及浓度下survivin基因表达量的改变。统计学方法:采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学处理,计量资料用（?）±s表示,采用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD法。判定标准:P＜0.05有统计学意义。结果1.多西紫杉醇对Hep-2细胞生长的影响随着多西紫杉醇浓度的升高及作用时间的延长,对Hep-2细胞的生长抑制率也呈现出逐渐上升的趋势（P＜0.01）。研究得出多西紫杉醇对Hep-2细胞24h的IC50值为7.47ug/ml,95%CI[4.91～10.73];48h的IC50值为4.32ug/ml,95%CI[2.54～6.39]。2.细胞形态学的变化倒置显微镜下观察到药物作用后,细胞贴壁能力、折光性明显减弱,生长增殖明显受抑。多西紫杉醇作用4h即可见形态改变,当浓度至80μg/ml作用72h,可见大量细胞漂浮,细胞形态由多边形、长梭形,变为类圆形。3.流式细胞术检测Hep-2细胞的凋亡低浓度多西紫杉醇（3.7ug/ml）作用细胞24h后出现凋亡峰（亚G1峰）,之后的48h组凋亡率明显增加（p＜0.05）。高浓度（15.0μg/ml）作用24h后也出现凋亡峰,且其表达量略高于低浓度药物作用24h组（p＜0.05）。G2/M期阻滞的高峰出现在多西紫杉醇作用Hep-2细胞后的12h,随后的24、48h G2/M期细胞阻滞的比例逐渐下降。4.多西紫杉醇作用Hep-2细胞中survivin mRNA表达的变化多西紫杉醇高、低浓度作用Hep-2细胞后,存活细胞中survivin mRNA基因的表达均高于阴性对照（P＜0.05）,但是高、低浓度间的差异无统计学意义（P＞0.05）。而低浓度连续作用后,随着作用时间的延长,存活细胞中survivinmRNA表达量逐渐增加（P＜0.05）。药物处理12、24、48h后的存活细胞内的survivinmRNA的表达量分别为阴性对照组的1.40倍、2.76倍、3.68倍。结论1.多西紫杉醇对喉癌Hep-2细胞的生长有明显的抑制作用,且有时间-浓度依赖性2.多西紫杉醇作用喉癌Hep-2后细胞凋亡峰出现在G2/M期阻滞之后,提示多西紫杉醇诱导的细胞G2/M期阻滞是凋亡发生的重要前提3.多西紫杉醇作用喉癌Hep-2后存活细胞survivin mRNA的表达量逐渐增加,提示多西紫杉醇作用后存活细胞凋亡抑制基因survivin的高表达,与喉癌细胞对多西紫杉醇的耐药性有关