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目的:本课题基于高尿酸血症小鼠模型评价树舌灵芝和茯苓的降尿酸作用、毒理学作用并初步探讨其作用机制,为验证传统利尿药用菌降尿酸作用提供思路和方法。方法:1.树舌灵芝、茯苓的提取(1)醇提法分别提取树舌灵芝和茯苓中脂溶性物质;(2)水提法提取树舌灵芝和茯苓中亲水性物质;(3)将醇提物和水提物减压浓缩后冻干,计算得率。2.探讨树舌灵芝、茯苓对高尿酸血症小鼠的降尿酸作用(1)使用氧嗪酸钾和次黄嘌呤联合造模建立高尿酸小鼠模型;(2)对高尿酸小鼠灌胃树舌灵芝、茯苓提取物给药,同时设置别嘌呤醇和苯溴马隆阳性对照组;(3)眼眶取血后分离血清用于测定血尿酸含量,采集尿液测定尿尿酸含量。3.探讨树舌灵芝、茯苓对高尿酸血症小鼠的毒理学和对潜在靶标的影响(1)测定高尿酸血症小鼠血清中的肝肾功指标参数;(2)称量肝、肾、脾脏、胸腺,根据小鼠体重计算脏器系数;(3)利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(WB),测定肾、肠组织中尿酸转运代谢相关蛋白的基因和蛋白表达情况;(4)取福尔马林溶液固定的肝、肾组织以石蜡包埋后切片、再进行苏木素-伊红染色,观察小鼠肝肾组织的病理改变。4.探讨树舌灵芝和茯苓改善高尿酸血症的分子机制(1)测定黄嘌吟氧化酶(XOD)的活性水平;(2)从现有的中药开源数据库和文献中检索得到树舌灵芝与茯苓的成分化合物,分别整合建立成树舌灵芝、茯苓小分子库;(3)根据尿酸转运代谢相关蛋白的基因和蛋白表达情况和XOD的结果,选择适合的靶标蛋白和建立好的小分子化合物库进行分子对接,筛选出适合的降尿酸候选小分子;(4)对候选小分子:2’,5’-二羟基苯乙酮DHAP进行药效、毒理学以及机制研究。结果:1.树舌灵芝、茯苓粗提物提取率树舌灵芝醇提物GAE得率为3.78%,水提物GAW得率为8.53%。茯苓醇提物PCE得率为1.22%,水提物PCW得率为1.29%。2.高尿酸血症小鼠模型探讨树舌灵芝、茯苓的降尿酸作用GAE、GAW、PCE和PCW均能有效降低高尿酸血症小鼠的血尿酸含量而且存在量效关系,其中GAE、GAW和PCW治疗组的血尿酸水平甚至近似正常对照组。同时,树舌灵芝、茯苓的提取物能够促进尿酸从尿液中排出。3.树舌灵芝、茯苓对高尿酸血症小鼠的毒理学影响肝和肾的血清功能指标、脏器系数和病理切片表明树舌灵芝和茯苓均具有一定的保护肝肾的功能。4.树舌灵芝、茯苓对治疗高尿酸血症潜在靶标的影响树舌灵芝提取物对血XOD有一定的抑制作用,茯苓提取物则能够一定程度上抑制肝脏中XOD活性。GAE和GAW能够下调肾GLUT9和肠道CNT2并上调肾OAT1,其中 GAE 还能够抑制肾 URAT1。PCE 和 PCW 对肾 ABCG2、OAT1、OAT3和OCT2的mRNA和蛋白均有上调作用。5.筛选树舌灵芝、茯苓中降尿酸小分子结果整合得到树舌灵芝小分子共84个,树舌小分子库与XOD和URAT1分别进行分子对接;整合得到茯苓小分子共54个,茯苓小分子库分别与XOD和ABCG2进行对接。通过对接,验证了树舌灵芝和茯苓中均能作用于XOD,同时发现茯苓小分子对XOD的作用更为强烈。其中,筛得树舌灵芝小分子2,5-二羟基苯乙酮(DHAP)作为下一步研究的研究对象。6.验证降尿酸候选小分子的药效、毒理学和分子机制DHAP能有效降低高尿酸血症小鼠的血尿酸。本实验通过对接模拟DHAP对XOD的结合方式,以及测定DHAP对体外XOD活性和高尿酸血症小鼠体内XOD活性的影响,发现DHAP对XOD有一定的抑制效果。肾功能指标和肾脏系数表明DHAP能够一定程度上减低肾损伤。但肝脏系数结果说明DHAP也存在肝损伤的可能性。WB和RT-PCR结果证明DHAP通过抑制URAT1,GLUT9和CNT2以及升高OAT1mRNA达到降尿酸的机制。结论:1.树舌灵芝、茯苓提取物均能够有效降低高尿酸血症小鼠的血尿酸水平,促进尿酸排泄,符合中医药对两者为利尿药的定义。同时,树舌灵芝还能够恢复高尿酸血症造模带来肝、肾损伤。2.树舌灵芝、茯苓均有可能对XOD产生抑制作用。通过WB和RT-PCR结果发现树舌灵芝提取物可能通过调节肾脏和肠道中的尿酸转运代谢蛋白而促进尿酸排泄;茯苓提取物则通过调节肾尿酸转运蛋白而促进尿酸排出体外。3.分子对接结果表明树舌灵芝和茯苓提取物中均具有至少2个靶标以上的化合物,且树舌灵芝和茯苓都作用于XOD上。4.树舌灵芝小分子DHAP能够有效降低高尿酸血症小鼠的血尿酸水平,该作用与抑制XOD活性相关。但存在损伤肝功能的可能性。