论文部分内容阅读
本论文的研究内容主要包括两个部分:1)番茄花叶病毒外壳蛋白与烟草IP-L的相互作用研究;2)水稻黑条矮缩病毒P9-1的结构和功能研究。
先前利用酵母双杂交系统筛选到一个与番茄花叶病毒(ToMV)外壳蛋白(CP)相互作用的烟草蛋白,并命名为IP-L。初步研究表明该蛋白可能参与病毒的长距离运动。然而,IP-L的结构和功能及其与ToMV CP相互作用的分子机制仍不完全明了。本研究在原核系统里高效表达了IP-L并对其二级结构进行了研究,圆二色谱分析显示该蛋白主要由无规卷曲结构组成,该结果与用Markov chains方法预测的结果一致。用酵母双杂交和GST-Pulldown实验对IP-L和ToMV CP上二者相互作用位点进行了研究,结果表明二者依靠各自的α-螺旋区相互作用,IP-L N端的α-螺旋区域(1~20位氨基酸)为二者相互作用所必需,而ToMV CP中有2个α-螺旋区域(16~31位氨基酸、138~149位氨基酸)参与二者的相互作用。进一步的定点突变分析表明IPL中L9A、H12G和ToMV CP中N26A、T29A、N30A、N143A和T144A等突变会导致二者失去相互作用能力。为初步了解IP-L的功能,克隆了其启动子序列并进行了生物信息学分析,发现该序列除含有TATA盒和CAAT盒等基本顺式元件外,还含有若干光应答元件(LREs),这表明IP-L的功能可能与烟草光合作用有关。随后利用免疫印迹技术证实IP-L定位于烟草叶肉细胞中叶绿体的类囊体上,该结果与对启动子序列分析所得的结论一致。为初步了解IP-L及其与ToMV CP的相互作用在病毒感染中的作用,利用农杆菌介导的叶盘法获得了IP-L沉默和过表达的转基因烟草植株。攻毒实验表明在IP-L沉默的烟草植株中典型的花叶症状要延迟3-5天出现,且体内ToMV CP的积累水平要明显低于野生型和IP-L过表达的烟草植株。这些结果表明IP-L与ToMV CP的相互作用有利于后者在烟草叶绿体中的积累,并进而通过干扰叶绿体的功能和稳定性来促进花叶症状的发展。
呼肠孤病毒的复制和组装通常发生在寄主细胞质内的包含体中,这些包含体也被称为“病毒工厂”或病毒基质。水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)P9-1为一非结构蛋白,定位于染病植物和昆虫寄主细胞内的基质中。但是该蛋白在RBSDV侵染过程中的具体功能尚不清楚。本论文的第二部分即是对RBSDV P9-1的结构和功能的研究。首先克隆到RBSDV保定株的S9-1全长,并利用原核表达系统获得了P9-1的高纯蛋白,随后利用一系列生物物理、生物化学方法对其进行了分析。质谱和圆二色谱分析表明P9-1是一分子量为41.8 kDa的α螺旋结构蛋白,在磷酸缓冲液中高度稳定,Tm值达到75℃。凝胶过滤层析、酵母双杂交和化学交联实验表明P9-1能自身相互作用形成稳定的同型二聚体。此外,利用原生质体瞬时表达系统证实P9-1能在体内形成基质样物质。这些结果表明P9-1对RBSDV的早期感染十分重要,可在体内形成病毒基质,为病毒复制提供场所。