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生物防治一直是植物病害防治领域中的一个重要分支。然而，利用拮抗菌防治植物病害存在三个问题，一是从庞大的根际微生物群落中筛选拮抗菌的程序烦琐、工作量大；二是由于培养方法的缺陷，土壤中真正有功能的占优势的微生物无法分离筛选到；三是中选菌株施入土壤后受到土壤中各种因素的影响，未必能成为优势种群、发挥防病作用。因此这三个问题的解决将直接关系到利用拮抗菌进行植物病害生物防治这一策略能否进一步向前发展。随着分子生物学研究技术和手段飞速发展，通过对植物根际群落结构的功能性种群进行分子生态学分析，同时结合植物根系分泌物平板培养技术可以克服番茄青枯病拮抗菌筛选时工作繁琐、效率不高、使用效果不稳定的局限性，为快速有效地筛选番茄青枯病拮抗菌提供理论基础。为此，本研究开展了以下的工作。
1.不同番茄根际土壤微生物的多样性分析
本实验采用PCR-DGGE阐明了不同番茄结果期土壤根际微生物的群落结构和优势种群。实验表明：10个不同番茄抗病、感病品种以及健康植株和发病植株的根际土壤样品微生物群落结构存在差异，表现在不同土壤的DGGE图谱之间存在差异带。有些条带只存在于不发病的土壤中，这说明不发病的番茄根际可能存在可以抑制青枯病发生的拮抗菌。根据DGGE图谱，分析了健康植株和发病植株根际土壤条带的差异，确定了差异带，并通过挖胶回收克隆，获得了4个(编号为a，b，c，d)与拮抗功能相关的差异带；对4个差异带进行序列分析表明，与差异带a，b，c同源性最高的基本均为不能人工培养的细菌(Uncultured bacteria)，而差异带d则为Flavobacterium sp.。同时根据DGGE图谱，选择差异性最大、多样性指数最高、物种丰度最高的7号-1-m-1不发病土壤作为目标土壤，利用不同的果胶培养基从该土壤中分离回收细菌。
2.不同果胶培养基回收番茄根际细菌类群的能力分析
以番茄根系主要分泌物-果胶作为碳源，制备成PA、改良YPP、改良PM培养基、以及未添加果胶成分的改良YPG培养基，将土壤悬浮液涂布在不同的培养基平板上，30℃下培养，分离回收不同平板上生长的菌落，计算种类和数量。再利用平板计数和PCR-DGGE评价4种培养基回收番茄根际细菌菌群的能力。结果显示：与YPP、YPG、PM培养基相比，PA培养基能回收土壤微生物的种类最多，达42种。而且其DGGE指纹图谱在泳道上的跨度最大、条带多且亮度较为平均，与土壤样品的指纹图谱最接近。这说明该培养基最能模拟土壤的培养条件，可以满足多种微生物生长所需的营养条件，能回收菌群范围宽，是较为理想的培养基。而YPP、YPG培养基对我们所选的特异性DNA条带所对应的微生物具有富集作用。本实验基本建立了果胶培养基平板筛选回收番茄根际微生物的方法，评价了利用根系分泌物作为营养源在回收根际微生物的作用。研究结果也证实了番茄根际主要分泌物一果胶培养基确实能够更多地分离出番茄根系土壤中各种不同类型的细菌，显示出最高的优势菌群回收特性。
3.利用拮抗差异带快速筛选拮抗菌
根据前面步骤获得的与拮抗功能相关的4条差异带，利用地高辛标记试剂盒制成探针，然后与从不同的培养基上回收得到的128株细菌杂交，快速筛选拮抗菌。其中只有探针a和探针b具有较强的特异性，利用这两个探针共筛选出11个与拮抗差异带探针有杂交信号的菌株，菌株编号为PA-35、PA-40、YPP-9、PA-41、YPP-5、PA-38、YPP-15、YPP-9、PA-19、PA-39和PA-16。从杂交结果可以看出，通过菌落杂交成功的将DGGE指纹图谱中特异性条带所对应的菌株从纯培养物中筛选了出来。通过前面3步试验，初步建立起了植物青枯病拮抗菌快速有效筛选的技术体系。
4.筛选获得的拮抗细菌的拮抗能力以及防病能力测试
经过平板对峙培养实验证实了其中的3株菌株(PA-35，PA-40，YPP-9)对番茄青枯病有较强拮抗作用，1株(PA-38)拮抗作用较弱。同时，把平板拮抗试验筛选出来的有拮抗作用的菌株进行防病效果测试。结果显示，四株菌株无论单独使用还是混合使用对番茄青枯病均有不同程度的防病效果：混合菌的防病效果最好，达到72.7％；单一菌防病效果最好的是菌株PA-40，达到63.7％；菌株PA-35、YPP-9和PA-38的防病效果分别为54.5％、27.2％和18.2％。从植株的高度、干重以及湿重来看，拮抗菌对番茄生长的影响均与空白对照产生明显的差异。这说明四株菌株均对番茄植株有促生作用，其中PA-40的促生作用最强，其处理的植株比对照植株高7.57cm，干重和湿重也分别比对照重0.21g和1.41g。
5.拮抗菌的鉴定
从番茄根际筛选到的4株拮抗细菌经过经典方法和分子方法鉴定，初步确定为：PA-35可能为Uncultured bacterium；PA-40可能为Bacillus cereus；PA-38则可能为Uncultured Micrococcineae bacterium；YPP-9极有可能是Uncultured Bacillus Spp.，还需要进一步的鉴定分析。其中拮抗作用较好的2株菌为Bacillus cereus和Unculturedsoil bacterium。本研究利用分子生态学手段和平板技术初步建立果胶培养基平板回收番茄根际细菌的方法，而且利用菌落杂交技术实现快速、准确、有效地筛选植物青枯病拮抗菌，为植物青枯病的拮抗菌的筛选提供了技术支持。