1.前言　　 抑郁症是目前危害人类健康的主要疾病之一，对其病因机制的探讨是达到有效治疗的必要途径。传统抑郁症的“单胺学说”认为，抑郁的发生主要与单胺类神经递质如5-羟色胺(seretonin，5-HT)及去甲肾上腺素(noradrenalin，NE)水平低下有关。而与之相对应研制的抗抑郁药也主要是通过提高突触间隙5-HT和NE水平，从而发挥抗抑郁的作用。近几年来，研究热点逐渐由神经递质和神经内分泌激素转向对细胞因子的关注。抑郁症的免疫异常早就有过报道，九十年代以来，随着研究技术的发展，发现抑郁症患者常有炎性分子增高，提示免疫激活。近年来这方面的研究趋向于认为抑郁症的发生可能与免疫激活导致细胞因子分泌增多有关，提出了抑郁症的“细胞因子假说”，该假说强调抑郁症是一种心理神经免疫紊乱性障碍。因此对抗抑郁药的药理机制也提出了新的观点，即抗抑郁药是否通过抑制细胞因子的分泌从而发挥其抗抑郁作用。　　 细胞因子是免疫细胞产生的一大类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽，化学性质大都为糖蛋白。细胞因子包括白介素(interleukin，IL)、干扰素(interferon，IFN)、肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor，TNF)等几类，根据它们在炎症反应中的不同作用又分为致炎性细胞因子(如IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ等)和抗炎性细胞因子(如IL-4、IL-10等)。致炎性细胞因子中的Il-1、IL-6、TNF-α等是启动炎症反应的关键细胞因子，又称为前炎性细胞因子(pro-inflammatory cytokine)。众多细胞因子在体内或相互协同、或相互拮抗，构成复杂的细胞因子网络。　　 抑郁症的“细胞因子假说”起源于细胞因子与抑郁症关联的现象学。临床发现，细胞因子疗法引起抑郁症，免疫激活性疾病伴随抑郁症，抑郁症病人有细胞因子增高；动物实验表明，细胞因子可引起动物出现抑郁样病态行为，且可被抗抑郁药所逆转，而细胞因子缺失或其受体缺失则产生抗抑郁作用。细胞因子可通过以下几种机制导致抑郁症的发生。(1)影响神经递质：细胞因子可激活吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine2，3-dioxygenase，IDO)，该酶分解5-HT的前体色氨酸(tryptophan，TRP)，降低TRP的血浓度，使合成5-HT的原料减少，导致脑内5-HT含量下降；(2)影响神经内分泌功能：细胞因子不但能强效地激活下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA)轴，而且阻碍皮质激素对HPA轴的负反馈，造成HPA轴持久的活动过度。　　 近年来，越来越多的研究表明小胶质细胞过度活化以及炎症反应过程参与抑郁症的病理过程。小胶质细胞广泛分布于中枢神经系统，占胶质细胞总数的5％-20％。在正常脑内小胶质细胞胞体较小，突起细长，呈分枝状，处于未激活状态。当中枢神经系统遭受损伤，如炎症、外伤时，小胶质细胞可被激活，早期表现为胞体增大，细胞表面的突起紧缩，变短，增粗，从而由分枝状的静息小胶质细胞转变成无突起的激活的阿米巴样巨噬细胞，这些形态改变有利于小胶质细胞的阿米巴样运动及其吞噬功能的发挥。另外，激活的小胶质细胞能够分泌大量的炎症介质如肿瘤坏死因子、白细胞介素和一氧化氮(nitric oxide，NO)等，从而引发免疫炎症反应，参与到抑郁症的发病过程中。　　 氟西汀(fluoxetine)为选择性5-HT再摄取抑制剂(selective serotonin reuptakeinhibitors，SSRIs)类抗抑郁药，主要通过对中枢神经5-HT再摄取的抑制作用，增加5-HT在突触间隙的浓度，从而发挥其抗抑郁的作用。鉴于抑郁症的“细胞因子假说”和小胶质细胞活化与抑郁症的病理机制密切相关，我们假设抗抑郁药的药理机制可能包括对小胶质细胞活化释放炎症介质的抑制作用。因此，我们的实验旨在研究抗抑郁药氟西汀是否能够抑制由脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱发的小胶质细胞炎症介质的释放及其有关的分子机制，从而为进一步阐明抗抑郁药物的药理机制以及研制新型抗抑郁药物提供理论依据。　　 2.材料和方法　　 2.1 BV2细胞培养　　 BV-2细胞用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基培养，当细胞达到95％融合时用0.25％的胰酶消化细胞，进行细胞传代。　　 2.2原代小胶质细胞培养　　 取出生1-2 d的BALB/c小鼠，无菌条件下取脑，剔除软脑膜及血管，尽可能快速切碎组织，胰蛋白酶37℃消化20 min，1000 rpm/min离心5 min，弃上清，加入10％FBS DMEM/F12(含体积分数10万U/L青霉素、100 mg/L链霉素)培养基重悬细胞，接种至60 mm培养瓶中，37℃、5％CO2培养箱中静置培养14 d。其中每3 d换1次液。14 d后，用37℃恒温振荡器振荡(500rpm/min)2 h，收集悬浮细胞，1000 rpm/min离心5 min，弃上清，种植密度1 x106/ml。连续培养10 d，经过CD11b免疫荧光鉴定，其纯度可达97％，可以用于后续实验研究。　　 2.33-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]　　 在96孔板中接种BV-2细胞(5×104/孔)，置37℃，5％CO2培养箱孵育过夜。细胞经过不同的处理后，在培养后第24 h，加入MTT20μl(5 mg/ml)，4 h，再加入二甲亚砜(dimethysulfoxide，DMSO)200μl，溶解后用酶联检测仪测OD值，绘制细胞的生长曲线。　　 2.4酶联吸附免疫测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)　　 BV-2细胞经过相应的药物处理后，收集上清液，采用ELISA检测试剂盒测定TNF-α和IL-6水平。　　 2.5一氧化氮测量　　 BV-2细胞经过相应的药物处理后，收集上清液。以NO的稳定性代谢产物-亚硝酸盐作为检测NO的指标，用Griess法试剂盒测定。　　 2.6 RT-PCR　　 收集状态良好细胞，用Trizol抽提总量RNA，紫外分光光度计测定RNA浓度。逆转录为20μl反应体系。PCR反应体系为25μl。反应条件为94℃预变性5 min；94℃，30 s；60℃，45 s；72℃，30 s；延伸72℃，7 min，32个循环。电泳及半定量分析，扩增产物在1.2％琼脂糖凝胶电泳。　　 2.7 Western blot　　 总蛋白经抽提后蛋白定量，按照上样量为30μg的量计算上样体积，余下用上样缓冲液补足20μl，经加热变性处理后上样，电泳，5％浓缩胶60 V，12％～15％分离胶120 V；电转后移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1 h，一抗4℃过夜，洗膜3次，二抗室温1h，洗膜3次，暗室中ECL发光。　　 2.8免疫荧光　　 经实验处理后，PBS清洗细胞爬片，用多聚甲醛固定30 min；PBS漂洗，过氧化氢孵育10min，以消除内源性过氧化物酶活性；PBS漂洗，牛血清白蛋白封闭30 min；去除封闭液，加入相应的抗体，4℃过夜，PBS漂洗；加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的二抗避光室温孵育1 h，荧光显微镜下计数阳性细胞表达率。　　 2.9凝胶电泳迁移实验(Electrophoresis Mobility Shift Assay，EMSA)　　 提取BV-2细胞核蛋白并定量。将核蛋白与地高辛标记的寡核苷酸探针在缓冲液中充分结合后，用5％非变性聚丙烯酞胺凝胶进行电泳(220V，1.5h)，电泳结束后，用NC膜进行转膜(400 mA，30 min)，然后用化学发光法检测。　　 2.10双萤光素酶检测分析　　 BV-2细胞转染报告基因质粒后48h，加入细胞裂解液(PLB)，离心后收集细胞上清液。取20μl细胞上清，利用双萤光素酶检测试剂盒在萤光检测仪上检测萤火虫和海肾萤光素酶活力。用萤火虫/海肾萤光素酶活力比值来评价NF-κB的活性。　　 3.实验结果　　 3.1氟西汀抑制LPS引起的小胶质细胞活化　　 在研究氟西汀的作用之前，首先进行了MTT实验以检验氟西汀是否对小胶质细胞具有毒性。MTT结果显示，经过24小时的孵育，只有在50μM浓度下，氟西汀才对小胶质细胞产生明显的毒性。而其他浓度(0.1μM，1μM，10μM)的氟西汀对细胞均是无毒性的。　　 CD11b是小胶质细胞激活的标志。在LPS刺激下，原代小胶质细胞表达较高水平的CD11b，而氟西汀能够明显地抑制这种由脂多糖引起的CD11b表达。　　 3.2氟西汀对细胞因子的作用　　 LPS刺激小胶质细胞24h后，BV-2细胞能够分泌大量的细胞因子包括TNF-α和IL-6，而氟西汀能够剂量依赖性地减少上述细胞因子的分泌。为了阐明氟西汀抑制细胞因子分泌作用的机制，我们通过RT-PCR技术分析了炎症因子的基因表达，发现氟西汀能够抑制上述细胞因子基因的表达。　　 3.3氟西汀对一氧化氮的影响　　 为了研究氟西汀对一氧化氮的影响，我们测量了小胶质细胞NO的分泌，同时我们应用RT-PCR、Western Blot和免疫荧光技术，从基因和蛋白水平检测了与NO分泌密切相关的iNOS的表达情况。结果证实，氟西汀能够从这两个方面抑制由LPS引起的iNOS的表达。　　 3.4氟西汀对促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)的影响　　 由于MAPK信号传导通路与炎症介质密切相关，所以我们试图研究氟西汀是否通过影响MAPK通路从而发挥了它的抗炎作用。Western Blot结果表明，由LPS引起的p38 MAPK磷酸化能够被氟西汀所抑制，而另外两种蛋白ERK1/2和JNK却没有受到影响。同时我们也通过免疫荧光技术进一步验证了上述结果。　　 3.5氟西汀对NF-κB的作用　　 NF-κB是细胞因子的重要上游调控信号。Western Blot结果显示，氟西汀能够抑制由脂多糖引起的IκB-α降解和NF-κB磷酸化，而EMSA和luciferase assay结果更加证实了氟西汀能够影响到细胞因子的调控和表达。　　 综合以上结果，我们认为氟西汀能够显著抑制由LPS刺激小胶质细胞活化分泌的TNF-α，IL-6和NO，而且氟西汀的这种抗炎作用是通过p38MAPK和NF-κB两条信号通路实现的。我们的结果提示氟西汀的治疗效应部分是通过它抑制小胶质细胞活化的抗炎作用实现的，由此进一步阐明了抗抑郁药物的药理机制并为研制新型抗抑郁药物指明了方向。