背景:急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一类具有高度异质性的疾病群,也是发病率逐年增高的血液系统恶性肿瘤之一。随着分子遗传学、分子生物学、二代测序等技术的发展,对AML的病因学、病理学的认识已有明显的提高,但是AML具体的发病机制仍未能明确。随着分子靶向药物和嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,CAR-T)及造血干细胞移植的进一步推广,虽然使AML的治疗进入了新领域,但是与传统化疗相比除了治疗成本高外,长期疗效还有待于进一步确认。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学后系统生物学中又一新兴的重要分支,通过代谢组学分析AML代谢谱,有助于揭示与AML发生发展有关的异常代谢,从而为AML的分层治疗和预后评估提供新指标,并且在代谢通路中发现与肿瘤治疗相关的潜在新靶点。目前通过代谢组学研究肿瘤细胞代谢重编程的主要方向集中在葡萄糖和谷氨醜胺(Glutamine,Gln)代谢异常,肿瘤细胞对葡萄糖和Gln的摄取、利用、转化相对正常组织细胞都有显著的不同。Gln在细胞内有两条代谢通路,一是通过谷氨酰胺酶(Glutaminase,GLS)转化为谷氨酸(Glutamate,Glu),之后在谷氨酸脱氢酶(Glutamate dehydrogenase,GLUD)的催化下生成 α-酮戊二酸(α-Ketoglutaric acid,α-KG)。另外一条通路则是通过转氨酶的转氨基作用生成另外一种非必需氨基酸和α-KG,两条通路生成的α-KG都能进入三羧酸循环经有氧氧化为细胞生存提供能量。GLUD在人体内有GLUD1/2两种形式,以GLUD1形式为主。GLUD1在细胞内催化Glu向α-KG转化,并且为蛋白、核酸、脂肪酸的合成提供原材料,是Gln代谢关键酶之一。在前列腺癌和神经胶质细胞瘤的研究中表明,GLUD1与肿瘤的发生、发展、转移密切相关,而且对患者的预后有显著的影响。本研究中我们将着重研究GLUD1对AML预后及代谢的影响。目的:通过对比AML患者和正常人骨髓/外周血中单个核细胞GLUD1的表达水平,分析GLUD1的差异表达与AML患者预后之间的关系,研究GLUD1过表达/敲除对AML细胞株生物学功能的影响及对小鼠移植模型肿瘤负荷、生存的影响。探讨GLUD1的分子调节机制,利用定量代谢组学方法研究敲除GLUD1后AML细胞株代谢谱的改变,研究GLUD1抑制剂R-162对AML的影响。方法:(1)利用荧光定量PCR技术检测320例成人AML患者及19例正常对照中GLUD1的表达水平,分析GLUD1表达和AML患者预后之间的关系。(2)检测AML细胞株GLUD1的表达水平,挑选合适的细胞株过表达和敲除GLUD1,通过CCK8、克隆形成实验、药敏试验、流式检测细胞凋亡和细胞周期、Western Blot检测相关蛋白的改变进一步探索GLUD1在AML中的生物学功能。(3)小鼠尾静脉注射GLUD1过表达/敲除和对照组AML细胞株,建立小鼠移植模型,主要观察小鼠肿瘤负荷、生存。(4)利用miRNA测序技术,检测AML患者中miRNA表达的差异并通过生物信息学网站对可能调控GLUD1的miRNA进行预测,探讨GLUD1调控相关的分子机制。(5)色谱-质谱法进行定量代谢组学研究敲除GLUD1后AML细胞株代谢谱的改变,分析GLUD1在AML代谢紊乱中的作用。结果:(1)与正常对照相比GLUD1在部分AML患者中表达明显上调,高表达患者的总体生存率较差,且GLUD1高表达是AML患者独立的预后不良因素。(2)过表达GLUD1能促进AML细胞增殖;增强克隆形成能力;降低细胞对临床常用化疗药物的敏感性。敲除GLUD1抑制细胞增殖;降低克隆形成能力;促进细胞凋亡;增强细胞对临床常用化疗药物的敏感性。(3)过表达GLUD1能增加小鼠肿瘤负荷;缩短小鼠生存时间。敲除GLUD1降低小鼠肿瘤负荷,延长小鼠生存时间。(4)miR-493在GLUD1高表达的AML患者中表达下调。通过荧光定量PCR、Western-blot及荧光素酶双报告系统进一步证实miR-493可以调控GLUD1的表达。(5)GLUD1敲除后,Gln分解代谢被抑制,α-KG水平降低。转氨酶成为生成α-KG的主要途径。GLUD1敲除后,葡萄糖代谢降低,糖酵解途径受到抑制,细胞主要通过三羧酸循环获得能量。(6)R-162能抑制AML细胞增殖。结论:(1)GLUD1在部分AML患者中显著高表达,是AML患者预后不良的独立危险因素;(2)GLUD1在AML中发挥癌基因的功能;(3)miR-493在GLUD1高表达的AML患者中低表达,GLUD1是miR-493的直接靶点;(4)敲除GLUD1抑制AML细胞株Gln的代谢,抑制葡萄糖无氧酵解和还原羧化反应,增强三羧酸循环;(5)R-162能抑制AML细胞增殖。