第一部分 类风湿关节炎患者亚临床动脉粥样硬化相关因素分析研究背景类风湿关节炎(RA)是一种累及全身多关节、导致关节功能障碍的炎症性自身免疫疾病,其基本病理改变是关节滑膜炎症。RA患者的平均寿命较正常人低,心血管疾病(CVD)是RA患者的首要死亡原因。研究表明RA患者罹患冠状动脉粥样硬化性心脏病的危险性明显增高,传统的心血管病危险因素不能完全解释这一现象。大多数患者在病程早期无临床症状,但冠状动脉已发生病变,因此认为RA心血管事件的高发生率是其动脉硬化的快速发展所致。动脉粥样硬化和RA在发病机制上有许多相似之处,免疫系统异常在动脉粥样硬化疾病及RA的发展中都发挥重要作用。既往已有研究发现高疾病活动度、炎症介质、基因异常、异常脂质谱、内皮细胞活化、糖皮质激素的应用等等均可能是RA患者并发动脉粥样硬化的危险因素。但很多研究报道不一,结论不同。脂质代谢异常在RA患者中十分普遍,而在普通人群中,脂质代谢异常常与心脑血管疾病风险高度相关,因此这也能从一方面解释RA患者易合并心血管疾病。亚临床动脉粥样硬化能够预测患者出现心血管疾病的风险,其中冠状动脉钙化和主动脉钙化与冠心病风险高度相关。基于此,本研究以冠状动脉和主动脉钙化作为亚临床动脉粥样硬化的指征,重点观察真实世界中RA患者亚临床动脉粥样硬化与脂质谱、RA疾病活动度及其他心血管危险因素之间的关系。目的本研究旨在寻找RA患者动脉粥样硬化发生的危险因素,回顾性观察RA患者脂质谱特点、亚临床动脉粥样硬化发生率,以及性别、年龄、病程、疾病活动度、细胞因子、RA特异性抗体等临床特征。通过分析亚临床动脉粥样硬化与炎症因子、脂质谱、疾病活动度评分、RA抗体及其他心血管危险因素等的相关性,以期寻找到类风湿关节炎患者发生动脉粥样硬化的危险因素,有助于尽早干预,减缓心血管疾病的发生,提高患者预期寿命。方法1.选择2016.6-2018.4在烟台毓璜顶医院风湿科住院的类风湿关节炎患者共356例(男104例,女252例)作为研究对象。入选条件如下:①符合1987年ACR分类标准或2010年ACR/EULAR分类标准。②病情处于活动期,即DAS28多2.6。③排除冠心病、缺血性脑血管病患者。2.留取患者空腹静脉血,用以检测类风湿因子(RF)、抗CCP抗体、血沉、C反应蛋白、白介素-6、血脂谱,并计算血浆致动脉硬化指数(AIP)。3.评估病情,计算DAS28评分。4.所有入选患者行胸部高分辨CT,统计有无冠状动脉或主动脉钙化。5.通过单因素及多因素logistic回归分析研究各相关变量与动脉钙化之间的关系,通过秩相关分析研究血脂变量及炎症变量与抗CCP抗体及类风湿因子之间的关系,通过秩相关分析研究血脂变量与DAS28之间的关系,并应用logistic回归分析进行多因素分析。以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.单因素logistic回归分析发现性别、年龄、高血压、吸烟、病程、DAS28、Anti-CCP抗体、血沉、C反应蛋白、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、载脂蛋白B、血浆致动脉硬化指数(AIP)等与动脉钙化相关。2.多因素logistic回归分析显示男性、年龄大、长病程、AIP增高者与动脉钙化高度相关。3.抗CCP抗体阴性者低密度脂蛋白、载脂蛋白B水平较抗体阳性者更高。4.基于DAS28评分的低疾病活动组总胆固醇、高密度脂蛋白、载脂蛋白A1水平较中高度疾病活动组高,而脂蛋白(a)、AIP较中高度活动组低。结论1.采用冠状动脉和主动脉钙化为评估标准,RA患者中男性、年龄大、病程长、血浆致动脉硬化指数(AIP)增高与亚临床动脉粥样硬化相关。2.疾病活动度评分DAS28与脂蛋白(a)、AIP呈正相关。3.抗CCP抗体、RF与动脉钙化不相关。第二部分 类风湿关节炎患者不同治疗方案脂质谱变化研究背景心血管疾病是类风湿关节炎(RA)的一个重要合并症,严重影响患者预后,抗风湿药物对于心血管的安全性逐渐受到重视,临床实践中,除了达到控制关节炎症、促进疾病缓解或降低疾病活动度这一基本目标外,需要兼顾到个体RA患者的心血管风险。脂质异常是公认的心血管疾病的危险因素。脂质代谢紊乱在类风湿关节炎(RA)中较为普遍,多项研究发现与健康人群相比,RA初始阶段各项脂质谱降低,而RA的自身免疫异常和炎症过程可能促进动脉粥样硬化的发展。抗风湿治疗有利于控制炎症,但可能升高血脂水平。因此RA治疗过程中炎症与血脂的改变是否增加动脉粥样硬化和心血管疾病风险亦或起到保护作用仍未得到明确结论,不同的研究存在矛盾的结果。目的本研究为单中心、随机、对照研究,旨在观察传统治疗方案及生物制剂治疗前后RA患者疾病活动度及脂质谱变化,分析炎症指标和血浆脂质变化的特点,为进一步评估及调控RA患者动脉粥样硬化及心血管疾病风险寻找依据。方法1.选取2016.6至2018.1期间于烟台毓璜顶医院风湿科住院的类风湿关节炎患者。入选条件如下:①符合1987年ACR分类标准或2010年ACR/EULAR分类标准。②病情处于活动期,即DAS28≥2.6。③排除冠心病、缺血性脑血管病、高脂血症或者在服用降脂药患者。2.患者根据治疗方案分成三组:第一组:传统DMARDs(30例);第二组:托珠单抗组(30例);第三组:英夫利昔单抗组(30例)。3.留取患者空腹静脉血,用以检测类风湿因子、抗CCP抗体、血沉、C反应蛋白、血脂谱,计算血浆致动脉硬化指数(AIP)。评估病情,计算DAS28评分。4.治疗24周后复查上述指标。5.应用Wilcoxon signed-rank test分析三组患者治疗前后炎症及血脂变量的变化。应用秩和检验median test分析三组患者治疗前后各炎症及血脂变量的变化值有无差异,然后对有差异的相关变量,应用秩和检验Two-sample Wilcoxon rank-sum(Mann-Whitney)test进行两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.三组治疗后DAS28、血沉、CRP、类风湿因子均明显下降,其中DAS28下降幅度在托珠单抗组尤为显著。2.传统治疗组与托珠单抗组治疗24周后均可出现脂质谱变化,前者表现总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、载脂蛋白B上升,而后者表现为总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、载脂蛋白A1上升,脂蛋白(a)明显下降。英夫利昔单抗组治疗前后脂质无显著性变化。3.三组患者之间比较,血沉、甘油三酯、低密度脂蛋白、脂蛋白(a)、载脂蛋白A1、载脂蛋白B在治疗前后的变化值有显著差异,进行两两比较后发现传统治疗组与妥珠单抗组在血沉、低密度脂蛋白、脂蛋白(a)等变量中存在差异,传统治疗组与英夫利昔单抗组无明显差异,妥珠单抗组与英夫利昔单抗组相比仅有甘油三酯的变化值有差异。4.应用等级相关分析,spearman检验(p=0.039)和ktau检验(p=0.030)均发现脂蛋白(a)的变化值与DAS28的变化值呈正相关。5.三组治疗前后AIP均无显著变化,三组治疗之间对AIP的影响亦无显著差异。结论1.托珠单抗及传统DMARDs治疗可改变脂质谱,表现高密度脂蛋白增高,对动脉粥样硬化具有保护作用,但总胆固醇、甘油三酯亦增高,对动脉粥样硬化综合影响尚待确认。2.托珠单抗治疗可降低脂蛋白(a)水平,利于抗动脉粥样硬化。3.应用英夫利昔单抗治疗对脂质谱影响不大。4.生物制剂及传统DMARDs均可降低疾病活动度,生物制剂治疗组能够有效治疗传统DMARDs应答不佳的患者。5.三组治疗前后及三个治疗组之间相比AIP均无显著变化。第三部分 miR-212-3p在类风湿关节炎中的表达及作用机制探讨研究背景类风湿关节炎(RA)的病因仍有待阐明,最新的观点包括环境、蛋白质组学、表观遗传学和遗传因素的参与。在参与疾病的表观遗传因子中,微小RNA的作用越来越受到重视,它能够通过抑制mRNA的翻译和直接降解mRNA来负调节基因表达,从而降低靶蛋白的产生,抑制或促进疾病的发生和发展,也可作为个体代谢变化或疾病生成的早期标记物,并可监测疾病进程、预后和对治疗的反应等。近年来,越来越多的研究发现RA患者的外周血、滑膜组织、成纤维样滑膜细胞中miRNA表达的异常,且miRNA对T细胞、B细胞分化以及细胞因子网络均有调节作用。RA患者更易合并动脉粥样硬化(AS),导致心血管疾病(CVD)。近些年来的研究发现,多种基因或蛋白的表达上调或下降对AS的发生、发展起到了较为重要的作用。其中miRNA可调控内皮细胞、平滑肌细胞及巨噬细胞功能及炎症因子的分泌,在AS的发生及发展过程中发挥重要作用。不同的miRNA可有相同的靶基因,同一种miRNA亦可调控多种靶基因,因此某些miRNA可能对类风湿关节炎及动脉粥样硬化发生发展的一些环节共同起作用,从而促进RA患者动脉粥样硬化的发生,这可从基因水平解释RA易患AS的机制,例如miR-146a-5p和miR-155-5p,已报道可能对RA中CVD的发展起作用。基于以上研究背景,我们从可能对RA和AS均有调控作用的miRNA入手,以探究其在RA中的作用机制。miR-212-3p位于17p13.3,已被证实调节多种疾病的进展。既往研究多关注于其在肿瘤性疾病中的作用。一些miRNA表达分析研究指出miR-212-3p异常表达于RA患者血液,但miR-212-3p在RA中的具体作用机制仍不清楚。同时,我们在TargetScan数据库中检索到miR-212-3P的靶基因之一为丝裂原激活蛋白激酶(MAPK),MAPKs信号通路转导级联反应对动脉粥样硬化、心肌肥厚、血管再狭窄等多种心血管疾病的发病过程具有重要的调控作用,因此我们选择miR-212-3p为研究对象。目的分析miR-212-3p在RA患者和正常对照血清、滑膜组织和成纤维样滑膜细胞(FLS)的表达。通过功能性试验,调节miR-212-3p表达并检测对RA患者成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响。通过TargetScan检索miR-212-3p靶基因,并通过改变靶基因的表达验证其对RA-FLS增殖、凋亡的影响,以阐述miR-212-3p在RA发病机制中的作用。通过此项研究,为RA生物治疗寻找潜在的靶点。方法1.收集20例行关节滑膜切除术或关节置换术的RA患者血清和滑膜组织标本。10例正常血清及滑膜标本取自无慢性关节炎的外伤患者。2.应用qRT-PCR的方法检测miR-212-3p在RA患者及正常对照组血清、滑膜组织、成纤维样滑膜细胞中的表达。3.通过转染mmiR-212-3p的模拟物和抑制物,使用流式细胞术观察RA-FLS的增殖、细胞周期和凋亡,以进一步评估miR-212-3p对RA的调控作用。4.通过Targetscan发现SOX5为miR-212-3p的靶基因,并通过双荧光素酶实验进行验证。假设miR-212-3p通过调控SOX5的表达影响RA-FLS的增殖和凋亡。5.利用qRT-PCR测定RA患者血清、滑膜组织和FLS中SOX5 mRNA表达水平。6.在miR-212-3p模拟物处理的RA-FLS中过表达SOX5,采用蛋白质印迹法测定SOX5蛋白的表达水平。观察SOX5过表达状态下对RA-FLS增殖、细胞周期及凋亡的影响来明确SOX5在RA中的作用。结果1.与健康对照组相比,miR-212-3p在RA患者的血清、滑膜组织及成纤维样滑膜细胞(FLS)中表达下降。2.miR-212-3p过表达处理组中,RA-FLS的增殖能力下降,从而提示miR-212-3p抑制RA患者FLS的生长。3.miR-212-3p的过表达组中,RA-FLS的G0/G1期的百分比较高但S期较低,且凋亡明显增加。而miR-212-3p抑制组中,RA-FLS凋亡减少。因此miR-212-3p可以调节RA-FLS中的细胞周期和凋亡,表现为抑制RA-FLS增殖、促进凋亡。4.通过双荧光素酶报告系统证明S0X5是miR-212-3p的靶基因。并且,miR-212-3p模拟物组中S0X5表达显著降低,而在miR-212-3p抑制物组中,S0X5显著高于对照组。证实S0X5是miR-212-3p的直接靶基因。5.通过qRT-PCR检测发现RA滑膜组织中S0X5表达水平升高并与miR-212-3p表达呈负相关。6.SOX5的过表达可逆转miR-212-3p对RA-FLS的影响,进一步证实miR-212-3p可以通过靶基因SOX5来调节RA-FLS功能。结论我们首次证实RA患者的血清、滑膜组织和RA-FLS中miR-212-3p的表达水平降低。miR-212-3p通过抑制RA-FLS中的SOX5表达,进而抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。该研究表明miR-212-3p可能成为RA生物治疗的潜在新靶点。