实验目的:　　 疟疾是疟原虫经媒介按蚊传播的严重威胁人类健康的感染性寄生原虫疾病。每年疟疾临床病例在2～3亿左右，其中近百万人因感染疟疾死亡。红内期恶性疟原虫(Plasmodium falciparum，P.f)引起的脑型疟疾(简称脑疟，cerebral malaria,CM)是重症患者致死的主要原因，因CM导致的死亡人数占疟疾总死亡人数的80％,而幸存者仍长期伴有神经系统损伤症状。大量的研究表明，致死型脑疟等严重并发症的出现与机体过强的Th1型应答密切相关。血清中过量的前炎症因子，尤其是IFN-γ、 TNF-a和NO参与CM的发生，并与高死亡率呈正相关。　　 伯氏疟原虫(Plasmodium berghei ANKA，P.b ANKA)感染的鼠疟模型疾病感染过程与P.f疟疾感染的临床表现有许多共同之处，是研究人类疟疾疾病的最佳模型。研究表明，CM是脑血管内感染红细胞(parasitized red blood cells，pRBC)的黏附和细胞因子与效应细胞介导的宿主强烈前炎症应答的结合效应。相关研究表明活化T细胞介导的免疫应答参与疾病诱导，并且CD4+T细胞和CD8+T细胞均有利于脑病变发生。事实上，Th1型免疫应答在控制虫血症方面发挥关键作用的同时也促进CM发生。　　 促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是一种糖蛋白，在成人体内主要由肾脏产生，并能够促进红系祖细胞分化为成熟的红细胞，增加循环中红细胞数量。EPO除了众所周知的的造血功能外，还具有抗炎、抗氧化和抗神经细胞凋亡的作用。研究证实，除了红系祖细胞外，其它类型的细胞包括免疫细胞也表达EPOR，但尚不清楚这些受体的功能。新的研究表明，EPO可以调控免疫应答的强度，EPO对传染病和炎症性疾病有明显影响，并对新治疗策略的设计大有益处。P.b ANKA感染C57BL/6小鼠，通过EPO治疗能够提高其存活率，并减少小鼠脑神经干细胞的凋亡。近些年的小鼠脑疟模型实验中，也证实了rhEPO的治疗可以减少小鼠脑内前炎症细胞因子的表达。EPO通过抑制前炎症细胞因子的表达，保留内皮细胞的完整性和保护血脑屏障的通透性来抑制炎症反应。为此，我们研究了EPO对实验性脑疟模型(P.b ANKA感染C57BL/6小鼠)中宿主免疫应答的影响。　　 实验方法:　　 1.实验动物处理、感染及原虫血症观察　　 EPO处理:C57BL/6小鼠随机分为2组:对照组;给药组（EPO处理组）。实验组分别于感染后d2-4静脉给予10U、50U、200U/只EPO，对照组在相同的时间点接受相同量的生理盐水。　　 小鼠感染:经腹腔感染1×106P.b ANKA寄生的红细胞(pRBC)，感染不同时间的小鼠经尾静脉采血，制备薄血膜，Giemsa染色，镜检计数红细胞感染率。　　 2.血脑屏障检测　　 于小鼠感染后d5静脉注射200μl伊文思蓝染料（2％ Evans blue dye，EB）（sigma公司），1小时后，经心脏灌注生理盐水直至流出清亮的液体为准，取脑并放入装有1ml甲酰胺（sigma公司）中号试管中，37℃温箱孵育48小时，3000 r/min离心15min，取上清液在于紫外分光光度仪上（波长630 nm）测定染料溢出物，检测血脑屏障(BBB)的通透性。　　 3.HE染色和免疫组化　　 小鼠大脑被固定在4％多聚甲醛中，然后石蜡包埋和切片，免疫组化法(IHC)方法如下:　　 1)石蜡切片，常规脱蜡脱水。　　 2)3％ H2O2（无色液体）室温孵育10分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。　　 3)蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟　　 4)抗原修复:枸橼酸钠缓冲液高压修复2分钟。自然冷却，再用PBS3分钟×3次。　　 5)血清封闭:37℃孵育30分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去，勿洗。　　 6)滴加适当比例稀释的一抗，4℃过夜（最好复温）。PBS冲洗，3分钟×5次。　　 7)滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育1小时。　　 8) PBS冲洗，3分钟×5次。　　 9)滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30分钟。　　 10) PBS冲洗，3分钟×5次。　　 11)显色剂显色（DAB等）。　　 12)自来水充分冲洗以终止显色。　　 13)可进行复染，脱水，透明。　　 14)封片剂封片。　　 4.脾细胞培养　　 无菌取出感染d0、3、5小鼠脾脏，用10％ FCS-RPMI1640培养液制成细胞悬液，1500rpm离心10min，用0.17 M NH4Cl裂解红细胞，RPMI1640洗涤两次。以含10％ FCS-RPMI1640调整脾细胞终浓度为1×107/ml，于24孔培养板上加入细胞悬液，500μl/孔，每组设2个复孔。于37℃培养48h。350g室温离心10min，收集上清，-80℃保存，待IFN-γ、TNF-α和NO2检测。　　 5.IFN-γ及TNF检测　　 用双抗体夹心ELISA法对小鼠脾细胞培养上清中的IFN-γ以及TNF的含量分别进行检测，酶标仪检测450nm处OD值。应用SoftMax Pro4.3.1 LS软件分析，绘制标准品标准曲线，计算细胞因子含量(pg/ml)。　　 6.NO2-检测　　 以Griess反应检测脾细胞培养上清中的NO2-含量，100μl上清和Griess反应液100μl室温反应10 min，用NaNO2作为标准品，酶标检测仪550nm处检测其OD值。　　 7.脾细胞样品制备及荧光抗体染色　　 无菌取出感染后d0、3、5小鼠脾脏，常规方法制备脾细胞悬液，用0.17mol/LNH4Cl裂解红细胞。用含10％胎牛血清(FCS)的RPMI1640调整脾细胞终浓度为1×107/ml。DCs检测:每份样品用抗CD11 c-FITC单抗、抗CD11b-PE单抗、抗CD45R/B220-PerCP单抗和抗MHCⅡ-APC单抗进行四色分析，另设阴性对照管，在预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体的流式细胞仪专用染色管中加入脾细胞悬液0.1ml，再加入抗CD11c-FITC单抗、抗CD11b-PE单抗和抗CD45R/B220-PerCP单抗进行表面染色，离心去上清后，用0.5ml PBS重悬浮细胞，流式细胞仪进行检测。TLR9检测:每份样品应用FITC标记的抗小鼠CD11c单抗和Biotin标记的抗小鼠TLR9单抗进行双色分析，另设单标CD11c单抗和TLR9单抗对照管。每管预先加入FcγⅢ/Ⅱ封闭抗体2μl。然后用抗CD11c-FITC单抗进行表面染色，振荡器低速混匀，冰浴放置，避光反应30min。每管加入2ml含2％ FCS的PBS，1500 rpm离心5min，弃上清，洗涤两次。然后加入固定透膜夜250μl，4℃孵育1h。再加2ml1×wash固定透膜洗液，1500rpm离心5min洗涤1次，弃上清。每管加100ul含2％FCS的PBS重悬细胞。加入抗-TLR9-Biotin mAb进行胞内标记，4℃孵育30 min。每管加入2ml含2％FCS的PBS，1500 rpm离心5min，弃上清，洗涤两次。加入抗-Streptavidin-PE进行胞内标记，4℃孵育30 min。每管加入2ml含2％FCS的PBS，1500 rpm离心5min，弃上清，洗涤两次。每管加入500μl2％多聚甲醛固定液重悬，静置15min，上机。　　 8.统计学处理　　 应用SPSS11.5统计学分析软件。单因素方差分析比较各组均值的显著性差异。P小于0.05为差异显著。　　 实验结果:　　 1.EPO处理显著降低P.b ANKA感染C57BL/6小鼠CM的发生　　 对照组小鼠在感染后d7，出现明显的脑疟症状（如抽搐，皮毛竖起，颤抖，肢体瘫痪，痉挛，昏迷等神经学症状），大多数小鼠与感染后d7-12死亡。为了确定EPO对实验性脑疟的保护性作用，我们在小鼠感染后d2-4尾静脉给予三种不同剂量（10，50，200 U/只/天）的重组人EPO(rhEPO)。与对照组相比，三种不同剂量的EPO都能对ECM发挥显著的保护作用。在三种剂量中，给予50U/只rhEPO实验组中，66％小鼠存活超过24天，存活时间最长，为此，采用此组剂量进行后续实验。相比生存时间，原虫血症在对照组与各实验组之间无显著差异。与正常小鼠相比，在感染后d3-5，小鼠外周血RBC计数发生波动，但是EPO组与对照组比较无明显差异。C57BL/6感染P.b ANKA后，血小板计数呈下降趋势，但是两组比较无明显差异。　　 2.EPO处理改善实验性脑疟的病理症状　　 在小鼠感染后d5，当小鼠出现脑疟症状时取脑。与正常小鼠相比，组织学检查显示，对照组小鼠脑血管内白细胞聚集物明显增多，并在小鼠脑组织的不同区域出现血管堵塞。相反，EPO组小鼠脑微血管中炎性细胞的沉积减少。另外，在对照组小鼠脑微血管中，免疫组化检测证实黏附分子ICAM-1、VCAM-1的表达增强，而EPO组表达减少。通过检测小鼠脑组织EB的含量作为评价血脑屏障完整性的指标。与对照组相比，EPO治疗组脑组织的EB渗出显著减少。　　 3.EPO处理降低血浆中TNF和IFN-γ水平　　 在小鼠感染后d5，对照组小鼠血浆中TNF和IL-10水平明显升高。然而，EPO组小鼠血清中TNF的水平在感染后d5明显降低。EPO组小鼠血清中IFN-γ的水平在感染后d5减少。相反，EPO组小鼠血清中抗炎症细胞因子IL-10的水平在感染后d5升高。　　 4.EPO抑制Th1细胞免疫应答　　 与感染后d0相比，EPO组Th1型细胞（CD4+T-bet+IFN-γ+细胞）的数量在感染后d3、5显著升高。与感后d0相比，对照组在感染后d3、5小鼠脾细胞中巨噬细胞(F4/80+细胞)的数量均出现升高趋势;与对照组小鼠相比，EPO组在感染后d3、5小鼠脾细胞中巨噬细胞的数量均减少。同时，在感染后d3、5，EPO组小鼠脾细胞培养上清中NO和IFN-γ的分泌水平出现显著降低。EPO组TNF的分泌水平也明显降低。同时，体外加入5 U/ml的rhEPO培养脾细胞，也可降低TNF和IFN-γ的分泌水平。　　 5.EPO处理提高Tregs数量并增加IL-10分泌　　 在小鼠感染后d3、5，检测脾细胞中CD4+CD25+Foxp3+Tregs的数量，发现与对照组相比，EPO组的数量均出现显著增高。同时，在小鼠感染后d5，检测脾细胞培养上清IL-10的分泌水平，发现EPO组升高。同时，体外培养脾细胞并加入rhEPO刺激，ELISA检测加入刺激物时IL-10的分泌水平升高。　　 6.EPO下调DCs数量　　 在小鼠感染后d3、5，与对照组相比，EPO组髓样DCs(mDCs)和浆样DCs(pDC)的数量显著减少。在小鼠感染后d5，EPO组中DCs表面分子TLR4和TLR9的表达也降低，感染后d3两组之间差异显著。　　 结论:　　 1.EPO处理显著降低P.b ANKA感染C57BL/6小鼠CM的发生;　　 2.EPO处理改善实验性脑疟的病理症状;　　 3.EPO抑制Th1细胞免疫应答，降低血浆中TNF和IFN-γ水平;　　 4.EPO治疗提高Tregs的数量并增加IL-10的分泌;　　 5.EPO下调DCs数量，并能抑制DCs的分化，下调其表面MHCⅡ和协同刺激分子的表达。